《Frontiers in Endocrinology》：Multilevel analysis of patients with hypophosphatasemia: genomic, epigenomic and isoenzyme activity profiles
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背景：低磷酸酶血症是低磷酸酯酶症（HPP）的生化标志，HPP是一种罕见遗传病，由ALPL基因致病变异导致组织非特异性碱性磷酸酶（ALP）活性缺陷所致。然而，大量持续低血清ALP水平（低磷酸酶血症）患者缺乏可识别突变，使诊断和管理复杂化。目的：采用整合多组学方法
背景：低磷酸酶血症是低磷酸酯酶症（HPP）的生化标志，HPP是一种罕见遗传病，由ALPL基因致病变异导致组织非特异性碱性磷酸酶（ALP）活性缺陷所致。然而，大量持续低血清ALP水平（低磷酸酶血症）患者缺乏可识别突变，使诊断和管理复杂化。目的：采用整合多组学方法和同工酶谱分析，研究无可检测ALPL突变成人患者低ALP活性的分子基础。方法：研究人员研究了50例低血清ALP成人患者和20例健康对照。遗传分析包括ALPL外显子和启动子的靶向测序，以及对突变阴性病例进行全外显子组测序。通过MassARRAY探索启动子甲基化，通过RT-qPCR测定ALPL mRNA表达。测定总ALP、骨特异性ALP和骨转换标志物。通过琼脂糖凝胶电泳分析同工酶组分。结果：在24例患者中鉴定出致病性ALPL变异，其余26例为非携带者。非携带者在ALPL启动子或与骨和矿物质稳态相关的其他基因中未发现可识别变异。同样，ALPL表达水平和启动子甲基化在各组间相似。与对照相比，携带者和非携带者的PINP和β-CTX水平均类似降低。相反，突变携带者表现出肝ALP同工酶显著降低，而突变阴性个体显示肝ALP活性相对保留。此外，在非携带者中，研究人员未发现血清总ALP与骨特异性ALP之间预期相关性。结论：综上，这些发现以及血清吡哆醛磷酸水平正常，提示在无ALPL突变的持续性低磷酸酶血症患者中，低血清ALP水平可能反映一种更多影响骨而非肝的酶缺陷。对这些患者的纵向随访将至关重要，以确定低ALP水平是否与长期肌肉骨骼后果相关。
研究背景：低磷酸酶血症是低磷酸酯酶症（hypophosphatasia，HPP）的生化标志。HPP由ALPL基因致病变异导致组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNAP）活性缺陷所致，是一种罕见遗传病。TNAP可水解无机焦磷酸盐（inorganic pyrophosphate，PPi）和吡哆醛-5′-磷酸（pyridoxal-5′-phosphate，PLP）等生理重要底物；PPi蓄积抑制羟基磷灰石结晶形成，损害骨骼矿化并导致骨软化、骨折等矿化缺陷。HPP临床谱广泛，从致死性围产期型到轻型成人型甚至无症状均可出现；成人HPP常因肌肉骨骼疼痛、复发性应力性骨折或早发牙齿脱落等非特异表现而漏诊或误诊，持续低血清ALP这一标志也常在常规实践中被忽视。迄今已报道超过500种ALPL致病变异，以错义变异为主，影响TNAP催化活性、细胞内转运或二聚化。持续低血清ALP是HPP的生化标志，但排除低磷酸酶血症继发原因后，约40–50%低血清ALP个体不携带ALPL编码序列或经典剪接位点致病变异，其ALP活性降低机制尚不清楚。已提出的解释包括深内含子变异、启动子或调控区突变、结构重排、影响基因表达的多态性，以及影响ALPL调控的其他基因变异；表观遗传机制也可能参与，ALPL启动子DNA甲基化已显示与基因转录呈负相关。TNAP在多种组织表达，循环ALP活性反映不同同工酶的综合贡献，骨特异性和肝组分的生化表征可提供组织特异性酶活性模式线索。目前，整合遗传、表观遗传、转录和酶学分析的低血清ALP个体研究仍较少，无ALPL突变的持续性低磷酸酶血症患者低酶活性机制未知，因此研究人员开展本研究。
关键技术方法概括：研究人员纳入50例持续低血清ALP成人患者（<40 U/L至少两次，间隔>6个月），来源于西班牙Santander的Hospital Universitario Marqués de Valdecilla，并设20例年龄性别匹配健康对照。遗传分析包括ALPL编码外显子及侧翼内含子靶向测序；突变阴性者行全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES），按GRCh37、人类表型本体（Human Phenotype Ontology，HPO）及ACMG/AMP过滤，并用Canvas评估拷贝数变异（copy number variation，CNV）；ALPL近端启动子行Sanger测序；MassARRAY EpiTYPER分析启动子DNA甲基化；RT-qPCR检测外周血ALPL mRNA，以GAPDH和RPL13A归一。测定总ALP、骨特异性ALP、I型前胶原N端前肽（procollagen type I N-terminal propeptide，PINP）、I型胶原β-C端端肽（β-C-terminal telopeptide of type I collagen，β-CTX）及PLP；琼脂糖凝胶电泳分析ALP同工酶。统计采用R。
研究结果：
3.1 遗传特征和研究队列一般特征（Genetic characterization and general characteristics of the study cohort）：通过ALPL测序，50例持续低血清ALP成人中24例（48%）携带致病或可能致病性ALPL变异，其余26例ALPL编码区无可识别突变。变异以杂合错义替换为主，包括两例复发杂合无义变异c.94C>T p.(Gln32Ter)、两个杂合框内缺失c.1318_1320del p.(Asn440del)和c.1101_1103del p.(Ser368del)，以及一例纯合c.407G>A p.(Arg136His)。携带者与非携带者年龄和性别分布相似；携带者慢性肌肉骨骼疼痛、钙化性肌腱炎和牙齿脱落患病率更高；4%携带者与32%非携带者无肌肉骨骼症状；65%携带者血清PLP升高，非携带者无PLP高于参考范围。基于HPO的WES表型驱动分析未发现可解释非携带者持续低磷酸酶血症的骨矿物质代谢或其他孟德尔病致病或可能致病变异。结论是，非携带者缺乏这些基因层面的解释，促使研究人员转向其他基因调控水平。
3.2 ALPL启动子分析和基因表达（ALPL promoter analysis and gene expression）：通过Sanger测序，患者和对照的ALPL近端启动子（转录起始位点上游约1 kb）未发现可解释组间ALP活性差异的序列变异。通过MassARRAY分析同一启动子区23个CpG位点，所有组均呈 uniformly 低甲基化（各CpG位点平均甲基化<20%），符合转录允许的低甲基化状态，患者与对照间无显著差异。通过RT-qPCR，外周血细胞ALPL表达在所有个体均可检测，突变携带者、突变阴性患者和对照间无统计学显著差异（p=0.134），组内个体间变异程度相似。结论是，启动子序列、启动子甲基化、其他骨相关基因及外周血ALPL表达均无差异，基因组因素不太可能是无ALPL突变低磷酸酶血症患者ALP活性降低的主要决定因素，后续分析转向循环酶同工酶的生化表征。
3.3 总ALP和骨特异性ALP（Total and bone-specific ALP）：在持续低磷酸酶血症个体中，ALPL突变携带者总血清ALP活性显著低于突变阴性患者（20±5 vs 32±6 U/L；p<1×10
?6），两组均显著低于对照（56±16 U/L）。与对照相比，低磷酸酶血症者骨转换标志物β-CTX和PINP显著降低（β-CTX：0.251±0.146 vs 0.340±0.220 ng/mL，p=0.005；PINP：34.9±14.6 vs 48.9±24.4 ng/mL，p=0.0006）；但携带者与非携带者间β-CTX和PINP无显著差异。骨特异性ALP在突变携带者中低于突变阴性患者（7.5 vs 10.1 U/L；p=0.018），并远低于对照（19.3±5.9 U/L）。对照和ALPL突变携带者中总ALP与骨特异性ALP呈显著正相关（r=0.78，p=0.0003；r=0.50，p=0.019），而突变阴性低总ALP个体无显著相关（r=0.12，p=0.598），提示该组总ALP与骨来源ALP活性解离，可能反映组间组织特异性差异。结论是，非携带者虽骨转换标志物降低，但总ALP与骨特异性ALP不相关，提示其ALP缺陷具有组织分布特点。
3.4 同工酶电泳谱（Isoenzyme electrophoresis profiles）：通过琼脂糖凝胶电泳，研究人员识别出主要骨和肝H1同工酶、较少见的肝H2同工酶及肠同工酶；免疫法测定的骨特异性ALP与电泳法结果良好相关（r=0.76，p<10
?11）。尽管个体间变异较大，主要肝同工酶H1相对丰度在对照与突变阴性低总ALP患者间相似（40.4±15.3% vs 38.5±18.5%），而ALPL突变携带者H1分数显著降低（26.9±20.2%；与非携带者比较p=0.004）。携带者与非携带者间H2肝同工酶、肠同工酶和骨同工酶相对比例无显著差异。按绝对活性计算，总肝ALP活性在突变携带者中显著低于非携带者（6.1±4.1 vs 13.9±7.5 U/L；p=0.0001）；绝对骨同工酶活性在携带者中稍低于非携带者（12.7±5.0 vs 18.6±6.5 U/L；p=0.003），并低于对照（28.8±10.0 U/L）。个体骨/肝比在非携带者中稍低，但变异大且差异不显著（1.7±1.1 vs 2.0±1.3）。总结显示，突变携带者肝分数降低幅度大于骨分数。结论是，尽管携带者与非携带者生化表型重叠，二者可能通过不同机制发生ALP缺陷；非携带者肝ALP相对保留、骨ALP降低，且总ALP与骨ALP解离。
讨论部分总结：本研究整合基因组、表观基因组、转录组和同工酶数据，旨在阐明无可检测ALPL突变患者低血清ALP活性机制。ALPL启动子Sanger测序未发现组间序列改变；启动子甲基化在所有个体均低甲基化，不支持CpG高甲基化导致转录沉默，但DNA甲基化高度组织特异，不能排除肝细胞或成骨细胞中未在外周血检测到的表观改变。WES未发现与矿物质代谢或骨骼稳态相关、可解释ALPL突变阴性者表型的单核苷酸变异、插入缺失或拷贝数变异。外周血总ALPL mRNA水平保留不应解释为反对已鉴定变异致病性：突变阳性组多数为错义变异，预期影响TNAP催化、折叠、二聚化、细胞内转运或蛋白稳定性而非转录；杂合无义变异p.(Gln32Ter)可能导致突变转录本无义介导降解；RT-qPCR测总ALPL而不区分等位基因，野生型等位基因表达可能掩盖突变转录本降低；外周血转录水平也不反映骨或肝中的等位基因特异性表达或调控，因此组间ALPL mRNA相似不等于TNAP蛋白表达或酶功能保留。阴性基因组和表观基因组观察使研究关注点转向组织特异性酶分布。同工酶谱显示，非携带者肝ALP活性相对保留，而携带者肝和骨同工酶均降低；非携带者总ALP与骨特异性ALP不相关，而携带者和对照存在相关。骨转换标志物在携带者和非携带者中均降低，与既往报道一致；低骨转换标志物是HPP特征，ALP/P1NP比已被提出用于区分成人HPP与抗骨吸收治疗的骨质疏松。无额外HPP生化或遗传特征的低磷酸酶血症患者虽未报道明显骨矿化异常，但常有类似ALPL突变携带者和轻型成人HPP的肌肉骨骼主诉；肝ALP未严重受累也得到既往功能研究支持，即仅ALPL变异携带者对吡哆醇负荷出现异常生化反应，表现为PLP蓄积，而PLP主要经肝代谢。诊断命名方面，具有HPP临床表现和生化异常（低血清ALP及ALP底物升高）者可诊断HPP；携带致病ALPL变异但临床轻或无表现、伴低ALP和ALP底物升高者，有作者称“携带者”，研究人员等建议称“亚临床低磷酸酯酶症”；本研究关注的第三组为持续低ALP但无其他基础病、无ALPL变异且TNAP肝同工酶底物如PLP正常者，其仍可能存在细微骨转换改变，长期临床意义和轨迹尚未完全阐明，建议称为“意义未明的低磷酸酶血症”。局限性包括样本量限制细微效应检测、甲基化仅测外周血、未能采集肝和骨样本、未捕获组织特异性增强子变化、非携带者理论上可能存在嵌合但未见HPP体细胞嵌合报道、同工酶分析依赖电泳分离而未直接测定各型酶活性、生化测定未直接评估酶定位或翻译后调控。临床上HPP诊断常依赖持续低ALP结合ALPL致病变异；本研究表明无可检测突变并不排除异常骨转换或HPP样生化表型，需纵向随访以确定低ALP是否与长期肌肉骨骼后果相关，未来需纳入骨和肝组织分析以阐明机制并完善突变阴性低ALP病例诊断标准。
研究结论翻译：综上，这些发现以及血清吡哆醛磷酸水平正常，提示在无ALPL突变的持续性低磷酸酶血症患者中，低血清ALP水平可能反映一种更多影响骨而非肝的酶缺陷。对这些患者的纵向随访将至关重要，以确定低ALP水平是否与长期肌肉骨骼后果相关。
