日本流产牛胎盘与阴道黏液中Waddlia chondrophila的分子检测

《Veterinary Microbiology》：Molecular Detection of Waddlia chondrophila in Aborted Bovine Placental and Vaginal Mucus Samples in Japan

　　

本研究旨在评估日本奶牛流产或死胎病例中衣原体相关细菌（CRB）DNA的存在情况及其潜在关联。研究人员对2023年8月至12月期间来自日本五个县的29头奶牛的阴道黏液和胎盘样本进行了分析。首先，利用下一代测序（NGS）对混合样本进行初步筛查，发现了Waddlia chondrophila和Parachlamydiaceae家族的相关序列。随后，采用多重和单重实时荧光定量PCR（real-time PCR）对所有29份阴道黏液样本进行检测，结果在一份样本中检出了W. chondrophila DNA，而Parachlamydia acanthamoebae未被检出。与该阳性样本对应的胎盘组织同样经实时PCR确认为阳性。基于16S rRNA基因片段的系统发育分析进一步证实了该病原体的分类学地位。定量分析显示，该阳性奶牛的胎盘组织中W. chondrophila的平均拷贝数为2.36×106 copies/g，显著高于阴道黏液中的3.465×104 copies/mL。利用HeLa 229和Vero细胞进行的病原体分离尝试未获成功。针对同一混合样本池中由NGS提示的其他可能致流产病原体（如Coxiella burnetii、Listeria monocytogenes等）的PCR验证均为阴性。这是首次在日本乃至亚洲地区报道W. chondrophila与牛流产相关的分子证据，表明该病原体可能是一种被忽视的牛生殖道病原体，其高胎盘载量提示其在流产发病机制中扮演重要角色，有必要对其进行持续的监测与研究。

论文解读文章

1. 研究背景与目的

牛流产和死胎给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。尽管常规疫苗接种已降低了多种病毒性疾病的发病率，但环境中仍存在大量可感染胎盘或胎儿的病原体。许多仅表现为流产而无其他明显异常的病例常被忽视，导致病因难以查明。在日本，由于诊断所需的成本和工作量，大量病例的病因仍不明确。衣原体目（Chlamydiales）包含一类被称为衣原体相关细菌（Chlamydia-related bacteria, CRB）的微生物，其中Waddlia chondrophila和Parachlamydia acanthamoebae在欧洲和非洲已被证实是人和动物肺炎及流产的潜在病原体。然而，在日本，关于W. chondrophila在哺乳动物中的研究尚属空白。因此，本研究旨在通过分子检测方法，评估日本奶牛流产病例中CRB的存在情况及其与流产的潜在关联，为揭示这些病原体在日本的生态学、宿主范围及公共卫生意义提供新的见解。

2. 研究方法

研究人员从日本五个县（北海道、岩手、广岛、东京、山形）收集了29头流产或死胎奶牛的阴道黏液和胎盘样本。主要关键技术方法包括：

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  样本采集与核酸提取：所有样本于流产或死胎后4天内采集。使用商业试剂盒分别从阴道黏液和胎盘组织中提取DNA。
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  下一代测序（NGS）分析：为降低测序成本并保留地域分组信息，将29份阴道黏液DNA样本按采样地区和时期分为5个混合池，13份胎盘DNA样本合并为一个混合池。对DNA和RNA文库进行双端测序。测序数据经质量控制、去除宿主序列后进行从头组装，并将获得的重叠群（contigs）与病毒、原核和真核数据库进行比对。
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  PCR检测：首先采用多重和单重实时荧光定量PCR对所有29份阴道黏液样本进行W. chondrophila和P. acanthamoebae的初步筛查。对阳性样本的对应胎盘组织进行相同检测。随后，使用探针法实时定量PCR（qPCR）对阳性样本进行定量分析。为进行序列确认和系统发育分析，研究人员设计了新的引物（SNWAD1/SNWAD3）扩增W. chondrophila的16S rRNA基因片段并进行测序。
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  其他病原体验证：对NGS结果提示的其他致流产病原体（如Coxiella burnetii、Listeria monocytogenes、Listeria ivanovii、Trueperella pyogenes及Chlamydiaceae家族成员），在阳性个体样本中进行特异性PCR验证。
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  病原体分离尝试：使用HeLa 229和Vero细胞系，尝试从阳性胎盘组织中分离W. chondrophila。

3. 研究结果

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  NGS检测到衣原体及致流产病原体：对混合样本的NGS分析揭示了多种原核生物相关序列，其中包括W. chondrophila、Parachlamydiaceae以及其他已知的牛致流产病原体（如Campylobacter fetus subsp. venerealis、C. burnetii等）。这一结果为后续聚焦W. chondrophila和P. acanthamoebae的研究提供了依据。
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  PCR检测发现W. chondrophila阳性病例：在所有29份阴道黏液样本中，仅有一份样本（编号HoO4）在两种不同的实时PCR检测中均呈W. chondrophila阳性。所有样本的P. acanthamoebae检测均为阴性。该阳性样本对应的胎盘组织也经实时PCR和探针法qPCR确认为阳性。
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  系统发育分析确认分类：对阳性样本扩增出的856 bp 16S rRNA基因片段进行测序和系统发育分析，结果显示其与Waddliaceae家族的W. chondrophila聚为一支，同源性达100%，从而确认了其分类学身份。
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  定量分析揭示高胎盘载量：对阳性奶牛的1份阴道黏液和3份不同部位的胎盘组织进行qPCR定量。结果显示，阴道黏液平均含3.465×10⁴ copies/mL，而三个胎盘位点的平均拷贝数分别为1.378×10⁶ copies/g、1.166×10⁶ copies/g和4.535×10⁶ copies/g，整体胎盘平均载量为2.360×10⁶ copies/g。胎盘中的细菌载量比阴道黏液高出约30至130倍。
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  病原体分离失败：使用HeLa 229和Vero细胞进行的病原体分离尝试未能在任何传代中观察到包涵体，qPCR也显示W. chondrophila DNA在各传代中逐渐消失。
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  阳性病例临床特征：阳性奶牛（HoO4）来自北海道，年龄2岁6个月，妊娠235天时被发现卧地不起并于当天确诊流产。临床检查显示体温过低（35.5°C）、心率减慢（40次/分）和高血糖（300 mg/dL）。该牛在临床检查过程中死亡。
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  排除其他共感染病原体：对HoO4个体的样本进行其他NGS提示的病原体（L. monocytogenes、L. ivanovii、T. pyogenes、C. burnetii）的特异性PCR检测，结果均为阴性。此外，在另一份样本（HoO8）中检测到Chlamydiaceae家族DNA，但未能进一步鉴定到种。

4. 讨论与结论

本研究的讨论部分指出，这是首次在日本乃至亚洲地区报道W. chondrophila与牛流产相关的分子证据，此前该病原体已在北美、欧洲和南非被报道，提示其全球分布。研究发现，W. chondrophila在胎盘中的载量远高于阴道黏液，这表明该病原体主要感染胎盘，并可能由此导致流产。这与先前一些研究中阴道拭子载量更高的观察并不矛盾，可能反映了感染的不同阶段，类似于Chlamydia abortus感染中阴道脱落量的动态变化模式。

研究结论总结如下：本研究首次提供了日本奶牛流产与W. chondrophila感染相关的分子证据。在胎盘组织中观察到的高细菌载量强调了W. chondrophila作为原发性致流产病原体的潜在作用。作为一种人兽共患病原体，W. chondrophila值得持续监测和研究，以更好地了解其流行病学、对人类健康的潜在影响以及在牛生殖损失中的作用。