CVA10感染乳鼠脑组织mRNA与长链非编码RNA转录组特征及免疫相关枢纽基因鉴定

《Virology》：Transcriptome analysis of mRNA and long non-coding RNA profiles in the brains of CVA10-infected suckling mice

由柯萨奇病毒A10（CVA10）引起的手足口病（HFMD）仍是重要的公共卫生问题。尽管多数感染为自限性，但重症病例可出现神经系统并发症，包括急性弛缓性麻痹和无菌性脑膜炎。然而，宿主对CVA10感染在中枢神经系统（CNS）内的转录反应仍知之甚少。在此，研究人员建立了CVA10感染的ICR乳鼠模型，并利用RNA测序（RNA-seq）对脑组织进行转录组分析，随后进行逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证。在CVA10感染小鼠脑组织中，共鉴定出243个差异表达mRNA和776个差异表达长链非编码RNA（lncRNAs）。干扰素刺激基因（ISGs），如Ifit1，在CVA10感染脑组织中表现出显著失调。整合的基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析显示，这些基因与先天免疫和炎症反应显著相关，尤其是干扰素相关信号通路。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析鉴定出10个免疫相关枢纽基因，包括Irf7、Rsad2、Isg15、Stat1、Ifih1、Ifit1、Ifit3、Oasl2、Rtp4和Usp18。RT-qPCR验证总体与RNA-seq结果一致，支持转录组分析的可靠性。长链非编码RNA（lncRNAs）可双向广泛调控这些免疫相关基因。这些结果为进一步研究CVA10相关神经疾病的分子基础，以及探索候选生物标志物和分子靶点提供了基础。

手足口病（HFMD）由多种肠道病毒引起，柯萨奇病毒A10（CVA10）属于肠道病毒A组，除典型皮损外，还可累及中枢神经系统（CNS），导致无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹，提示其具有神经侵袭潜能。既往动物感染模型显示CVA10可在脑组织复制并诱导组织病理改变；肠道病毒感染中的神经损伤不仅与病毒直接复制有关，也受CNS内宿主免疫反应影响。干扰素信号、炎症介质和抗病毒防御通路在多种病毒性神经感染中被报道，过度或失调的免疫信号与神经病理结局相关。然而，CVA10感染后CNS宿主转录反应仍缺乏系统研究，尤其是脑组织mRNA和长链非编码RNA（lncRNA）表达谱如何变化、哪些免疫/炎症/抗病毒通路及关键基因参与、差异表达lncRNA与免疫相关枢纽基因如何共表达尚不清楚，因此研究人员开展整合转录组分析。研究建立CVA10感染乳鼠模型并进行脑组织RNA测序（RNA-seq），鉴定出243个差异表达mRNA（DE-mRNAs）和776个差异表达lncRNA（DE-lncRNAs），发现干扰素刺激基因（ISGs）如Ifit1显著失调，免疫和炎症相关通路富集，筛选出10个免疫相关枢纽基因，且RT-qPCR验证与测序结果一致，提示lncRNAs可双向调控这些免疫相关基因。该研究为理解CVA10相关神经疾病的分子基础、候选生物标志物和分子靶点提供了转录组资源。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员以2020年分离自中国山东省HFMD患者粪便样本的CVA10株DZ20018感染三日龄无特定病原体（SPF）ICR乳鼠，采用肌内接种1×10^6.33 TCID₅₀（50%组织培养感染剂量）并采集脑组织；SPF怀孕ICR小鼠购自Ji’nan Pengyue Experimental Animal Center（中国济南）。研究采用RNA-seq进行全转录组测序，以DESeq2筛选差异表达转录本，开展GO与KEGG富集分析；基于STRING和Cytoscape构建PPI网络并用CytoHubba识别枢纽基因；计算lncRNA与枢纽基因Pearson相关性进行共表达分析；以RT-qPCR和2^-ΔΔCt法验证代表性差异转录本。

研究结果：3.1 CVA10感染乳鼠模型的验证：通过肌内接种CVA10并检测脑组织病毒载量和临床指标，研究发现病毒RNA在感染后3天（3 dpi）约为6.5 log₁₀ copies/μl，5 dpi达峰约7.5 log₁₀ copies/μl，随后下降；临床症状于3 dpi出现，5 dpi临床评分约4并伴后肢麻痹，感染鼠体重增长受损，7 dpi开始死亡；研究选择5 dpi脑组织进行转录组分析，RT-qPCR显示IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-13 mRNA升高。3.2 转录组测序数据评估：通过测序质量、比对和主成分分析（PCA），研究获得61,121,886–77,394,618条clean reads，Q20为98.64%–99.11%、Q30为96.33%–97.52%，93.99%–94.80%的clean reads比对到小鼠参考基因组，感染组与对照组在mRNA和lncRNA表达谱上明显分离。3.3 差异基因表达分析：通过DESeq2以|log₂(Fold Change)|>2且P<0.05筛选，研究鉴定243个DE-mRNAs（201个上调、42个下调）和776个DE-lncRNAs（512个上调、264个下调），层次聚类显示感染组与对照组分离。3.4 GO富集分析：通过GO富集，上调DE-mRNAs主要富集于干扰素-β应答、病毒应答、干扰素-γ应答、双链RNA结合等抗病毒免疫条目；下调DE-mRNAs富集于IL-6产生调节和炎症反应调节等；上调DE-lncRNA靶基因的生物学过程（BP）前10项中9项为免疫相关，下调DE-lncRNA靶基因富集于DNA损伤应答和内在凋亡信号等。3.5 KEGG通路富集分析：通过KEGG富集，上调DE-mRNAs显著富集34条通路，包括NOD样受体、RIG-I样受体、细胞因子-细胞因子受体互作和IL-17信号通路；上调DE-lncRNA靶基因富集28条通路并与上述免疫通路重叠；下调转录本的代谢相关通路富集有限，部分通路仅由单个差异基因代表。3.6 免疫相关DEGs的PPI网络分析：通过STRING/Cytoscape构建PPI网络并用8种算法筛选，研究获得189个节点、392对互作，鉴定Irf7、Rsad2、Isg15、Stat1、Ifih1、Ifit1、Ifit3、Oasl2、Rtp4、Usp18为免疫相关枢纽基因；凋亡、代谢和组织损伤相关差异表达基因（DEGs）也形成网络，Casp1/Casp4/Parp1、Pnpla2/Scarb1/Gpt、Hmgb1/Stat1/Mmp8等居前。3.7 lncRNA DEGs与枢纽基因的共表达分析：通过Pearson相关分析，研究发现多个上调DE-lncRNAs与Irf7等免疫相关枢纽基因呈正相关，部分与Irf7呈负相关；新鉴定TCONS_00042313、TCONS_00049002、TCONS_00125118与Irf7和Rsad2正相关；下调DE-lncRNAs亦与枢纽基因广泛正、负共表达，Isg15和Rtp4关联数最多。3.7 RT-qPCR验证DEGs：通过RT-qPCR验证代表性DE-mRNAs和DE-lncRNAs，表达趋势与RNA-seq一致，支持转录组数据可靠性。

讨论部分总结：讨论指出CVA10是HFMD的新兴病原且神经并发症日益受到关注，但CNS转录反应研究不足；本研究显示CVA10感染脑组织中Ifit1等免疫相关基因显著失调，转录反应以上调为主。GO/KEGG富集突出干扰素相关免疫反应、炎症信号和抗病毒防御通路；10个枢纽基因涉及病毒RNA识别、干扰素信号转导、下游抗病毒效应及干扰素信号负反馈调控。病毒相关KEGG通路富集反映保守宿主抗病毒反应的重叠，而不应解释为CVA10诱导相同病毒特异性机制；下调代谢通路因差异基因较少需谨慎解释。共表达分析提示lncRNAs与免疫相关枢纽基因存在正、负关联，但其调控作用仍需功能验证。局限包括仅分析RNA水平、全脑组织不能区分细胞类型、仅一个感染时间点以及关键基因和lncRNA功能尚未实验验证。结论翻译：本研究揭示CVA10感染乳鼠脑组织广泛的转录组改变；RNA-seq分析鉴定243个DE mRNAs和776个DE lncRNAs，上调基因多于下调基因；富集分析显示干扰素相关免疫反应、炎症信号和抗病毒防御通路显著参与；通过蛋白相互作用网络分析筛选出包括Irf7、Rsad2和Isg15等在内的10个免疫相关枢纽基因；RT-qPCR验证结果与转录组数据具有良好一致性，支持分析结果可靠性；lncRNAs可广泛双向调控这些免疫相关枢纽基因；研究结果为阐明CVA10的神经发病机制和预防HFMD提供了坚实基础，有助于理解CVA10相关神经疾病的分子反应，并为未来机制研究和候选分子靶点探索提供基础。