长期碳酸氢盐碱度暴露诱导拟穴青蟹（Scylla paramamosain）肠道毒性、菌群失调与代谢紊乱：精氨酸和脯氨酸代谢的保守响应

《Water Cycle》：Long-term exposure to bicarbonate alkalinity induces intestinal toxicity, gut microbiota dysbiosis and metabolic disorders in Scylla paramamosain

　　

长期暴露于碳酸氢盐碱度（bicarbonate alkalinity）可诱导拟穴青蟹（Scylla paramamosain）肠道毒性、肠道菌群失调（gut microbiota dysbiosis）和代谢紊乱（metabolic disorders）。碳酸氢盐碱度胁迫诱导拟穴青蟹肠道酸碱失衡（intestinal acid-base imbalance）；重塑肠道菌群结构并导致菌群失调；确定精氨酸和脯氨酸代谢（arginine and proline metabolism）为保守的核心响应通路；研究结果为盐碱水生态与健康养殖提供理论基础。

研究背景：拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是经济养殖蟹类，适宜盐度范围与盐碱水条件较为匹配。碳酸盐型盐碱地具有高碱度和高盐度特征，pH 7–9时HCO₃^?是水体碱度的主要成分并具有重要缓冲作用，但过高碱度会破坏水生动物酸碱稳态，引发代谢异常并限制生存和生长。已有研究表明高碱度可影响其他甲壳类的生长、肝胰腺组织结构、抗氧化和凋亡等，但高碱度对拟穴青蟹肠道的毒性效应及分子机制研究有限，难以为盐碱水养殖风险评估和肠道健康调控提供科学依据。因此，研究人员开展长期碳酸氢盐碱度暴露研究，以阐明拟穴青蟹肠道响应机制，并为盐碱水生态风险评估、肠道健康调控和产业可持续发展提供理论依据与技术支撑。

研究人员设置碳酸氢盐碱度100 mg/L（CK）、300 mg/L（B1）、500 mg/L（B2）和700 mg/L（B3）四组，进行28 d养殖，评价生长性能、肠道生化响应、代谢组和菌群变化。结果表明，长期高碳酸氢盐碱度暴露可导致拟穴青蟹生长受抑、肠道抗氧化和免疫功能下降、炎症与凋亡相关响应增强、酸碱调节能力受损、肠道菌群结构重塑并发生菌群失调、宿主代谢紊乱，其中精氨酸和脯氨酸代谢为各碱度胁迫组共同富集的保守核心通路。该研究揭示了碳酸氢盐碱度诱导拟穴青蟹肠道损伤的毒性机制，对盐碱水生态风险评估和健康养殖具有重要意义。

主要关键技术方法：实验蟹采自中国浙江省三门湾（E: 121°52'53"; N: 29°1'29"），选取体重15 ± 2 g健康个体360只，设100（CK）、300（B1）、500（B2）、700 mg/L（B3）碳酸氢盐碱度组，每组3个生物重复，进行28 d养殖并记录存活率、增重率和蜕壳率。采集肠道组织，测定抗氧化、免疫及炎症相关酶活性；采用qRT-PCR（quantitative real-time PCR）检测凋亡、炎症、免疫和酸碱调节相关基因mRNA表达；采用16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序（Illumina NovaSeq 6000）分析肠道菌群；采用LC/GC-MS非靶向代谢组学及OPLS-DA、KEGG分析；并进行微生物组-代谢组联合分析（mixOmics）；统计采用单因素方差分析、回归分析和Duncan多重比较。

研究结果：
3.1 碳酸氢盐碱度胁迫对拟穴青蟹存活、生长和消化酶活性的影响：通过28 d梯度暴露发现，随碳酸氢盐碱度升高，存活率、蜕壳率和增重率均下降，CK组最高，碱度超过300 mg/L后存活率明显下降；肠道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性在CK组显著高于B1、B2和B3组。
3.2 碳酸氢盐碱度胁迫影响拟穴青蟹抗氧化能力和免疫功能：通过肠道酶活和基因表达检测发现，随碱度升高，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总抗氧化能力（T-AOC）显著降低；酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）及免疫相关基因proPO、LZM、ALF1和Toll的mRNA表达下降。
3.3 碳酸氢盐碱度胁迫调控拟穴青蟹凋亡相关基因表达和炎症反应：通过炎症酶活及qRT-PCR检测发现，丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）活性升高，炎症相关基因TGF、IL-16、LITAF和RELISH的mRNA表达显著升高；凋亡相关基因CASPASE7、BAX和BCL2的mRNA表达在B1、B2和B3组均显著上调。
3.4 碳酸氢盐碱度胁迫损害拟穴青蟹酸碱调节能力：通过酸碱调节相关基因表达检测发现，NKA、NHE-RF1、Cl^?/HCO₃^? exchanger和CA的mRNA表达在B1、B2和B3组显著下调，表明肠道酸碱调节相关基因表达受抑制。
3.5 碳酸氢盐碱度胁迫对拟穴青蟹肠道菌群的影响：
3.5.1 肠道菌群多样性分析：通过Alpha多样性、热图聚类和PCoA分析发现，各组Good’s Coverage接近1，Chao1、Shannon和Simpson指数无显著差异，提示碱度未明显改变肠道菌群多样性和丰富度，样本聚类相对集中。
3.5.2 不同碳酸氢盐碱度下拟穴青蟹肠道菌群结构：通过门和属水平组成分析发现，优势门主要为Bacteroidota、Firmicutes、Proteobacteria和Campilobacterota；B3组Bacteroidota相对丰度最高，B1组Firmicutes最高，B2组Campilobacterota最高。属水平上，B3组Carboxylicivirga和ZOR0006占优，B2和B3组Sunxiuqinia显著高于CK和B1组，B2组Malaciobacter最高。
3.5.3 LEfSe、随机森林和KEGG预测分析：通过LEfSe分析（LDA阈值3）在B1、B2和B3组分别识别11、3和23个生物标志物；B1组以Alloprevotella、Odoribacter、Halomonas、Acidobacteriota和Gemmatimonadota等为主，B2组以Defluviitaleaceae_UCG_011和Photobacterium为主，B3组富集Sunxiuqinia、Carboxylicivirga和Halarcobacter；随机森林显示Sunxiuqinia、Carboxylicivirga、Malaciobacter和Sedimenticola为高重要性属；PICRUSt2预测47条KEGG通路，高碱组环境适应通路共同富集，免疫疾病相关通路随胁迫增强，并与潜在致病菌增加和宿主免疫能力下降相一致。
3.6 基于LC/GC-MS的碳酸氢盐胁迫对拟穴青蟹肠道代谢的影响：
3.6.1 数据验证：通过OPLS-DA分析发现不同碱度组间明显分离，模型具有良好解释和预测能力且无过拟合，表明肠道代谢物发生显著变化。
3.6.2 差异代谢物筛选：基于log₂FC、?log₁₀P和VIP筛选发现，B1/CK组798个上调、117个下调，B2/CK组519个上调、171个下调，B3/CK组637个上调、234个下调；上调类别普遍涉及Fatty Acyls、Prenol lipids、Steroids and steroid derivatives、Glycerophospholipids和Indoles and derivatives，代表代谢物包括3-oxododecanoylcarnitine等；B2组Thioproline、Val-Val-Ile、D-Glutamine、Resolvin E1和Prostaglandin E2等下降，B3组Leukotriene A3 methyl ester、Resolvin E1及多种PC species显著下降。
3.6.3 代谢通路分析：通过KEGG富集发现，B1/CK组有7条显著富集通路，B2/CK和B3/CK组各有9条；B1组主要包括Pyrimidine metabolism、Arginine and proline metabolism和Purine metabolism，B2组包括Arginine and proline metabolism、Arachidonic acid metabolism和Sulfur metabolism，B3组包括Arginine and proline metabolism、Galactose metabolism和ABC transporters；Arginine and proline metabolism在所有碱度胁迫组显著富集。
3.7 肠道菌群与代谢组联合分析：通过相关热图和特征成分相关分析发现，B1组Halomonas、Odoribacter和Mucispirillum与多种脂质、有机酸和生物碱代谢物强正相关，Defluviimonas、Lewinella、Nitrosomonas、Membranicola和Thioclava呈显著负相关；B2组Photobacterium与吲哚和氨基酸代谢物正相关，Subsaxibacter与生物胺和氨基酸代谢物广谱负相关；B3组Sunxiuqinia与PE(18:0/0:0)等磷脂代谢物强负相关，与S-(2-furanylmethyl) propanethioate等正相关，Thermomonas与citreoviridinol A1和trans-piceid强正相关。B1组脂质代谢物为核心差异特征，B2组Beta-Lactose、D-(-)-Ribofuranose和Formylisoglutamine与菌群负相关，B3组多数代谢物与菌群负相关，显示严重肠道微生态失衡。

讨论部分总结：高碳酸氢盐碱度降低拟穴青蟹存活、增重、蜕壳和消化酶活性；长期胁迫下肠道抗氧化酶和免疫相关基因表达下降，炎症相关酶及基因升高，凋亡相关基因上调，酸碱调节相关基因NKA、NHE-RF1、Cl^?/HCO₃^? exchanger和CA显著下调，导致肠道酸碱失衡和离子稳态紊乱。菌群优势门组成未根本改变但相对丰度重塑，潜在致病菌增加、有益菌受抑；代谢方面脂质代谢上调、甘油磷脂重塑、类花生酸免疫调节、氨基酸分解受抑、嘧啶/嘌呤代谢及精氨酸和脯氨酸代谢富集。菌群-代谢轴分析提示肠道微生态与宿主代谢协同失衡，进一步加重氧化损伤、免疫抑制、炎症、凋亡和肠道屏障损伤，最终导致消化吸收能力下降、生长受阻和存活率降低。

研究结论（译）：长期暴露于高碳酸氢盐碱度对拟穴青蟹肠道健康构成严重危害。高碱度诱导氧化应激、免疫抑制、炎症反应、细胞凋亡和酸碱稳态失衡；同时触发肠道菌群结构重塑、致病菌增殖及宿主代谢紊乱。精氨酸和脯氨酸代谢被确定为响应碱度胁迫的保守核心通路。该研究揭示碳酸氢盐碱度诱导拟穴青蟹肠道损伤的毒性机制，为盐碱水生态风险评估和健康养殖提供重要理论依据。