## 一、标题 斑马鱼模型揭示β诺达病毒基因型特异性感染差异及宿主先天免疫应答特征

《Transboundary and Emerging Diseases》：Zebrafish Reveals Genotype-Specific Differences in Betanodavirus Infection and Host Responses

　　

## 三、摘要翻译

鱼类病毒性脑病和视网膜病（VER）是由神经坏死病毒（NNV）引起的重要传染病，可感染养殖及野生鱼类物种。目前已鉴定出四种在易感物种中具有不同毒力的NNV基因型：赤点石斑鱼NNV（RGNNV）、条纹鲹NNV（SJNNV）、条斑星鲽NNV（BFNNV）和虎河豚NNV（TPNNV），此外还存在RGNNV与SJNNV之间的重配型病毒。鉴于该威胁，斑马鱼已成为进一步表征这些病原体并鉴定导致易感/抗性表型的细胞和分子机制的有前景模型。因此，本研究旨在比较斑马鱼对RGNNV、SJNNV和RGNNV/SJNNV感染的易感性，并从毒力和早期先天宿主免疫应答角度表征这些分离株的致病机制。所有颅内注射感染的幼鱼组均记录到疾病症状，病毒基因组定量证实三种分离株均可在斑马鱼幼鱼中复制。RGNNV组死亡率最高、出现疾病症状的幼鱼比例最大，同时病毒复制水平最高。因此，RGNNV似乎是斑马鱼幼鱼中致病力最强的分离株。值得注意的是，RGNNV和RGNNV/SJNNV接种幼鱼的I型干扰素（IFN I）应答及凋亡相关基因转录模式相似，其中干扰素调节因子3（irf3）和受体转运蛋白3（rtp3）为诱导程度最高的基因，而SJNNV接种幼鱼的基因上调幅度则低得多。RGNNV感染还诱导更强的炎症反应，包括中性粒细胞招募。经浸泡途径感染RGNNV的斑马鱼幼鱼病毒基因组显著增加，但感染被迅速控制。经肌肉注射感染RGNNV的幼年斑马鱼导致病毒迁移至中枢神经系统，但未记录到病毒RNA复制。斑马鱼在研究NNV-宿主相互作用的潜力促使进一步研究上述现象的潜在机制，这将有助于设计有效策略以保护易感NNV感染的养殖鱼类。

## 四、主体内容解读

### 研究背景

鱼类病毒性脑病和视网膜病（VER，viral encephalopathy and retinopathy），亦称病毒性神经坏死病（VNN，viral nervous necrosis），病原为神经坏死病毒（NNV，nervous necrosis virus），属诺达病毒科（Nodaviridae）β诺达病毒属（Betanodavirus）。该病毒为无囊膜小RNA病毒，基因组由两条正义RNA片段组成：RNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），RNA2编码衣壳蛋白（CP，capsid protein），复制过程中由RNA1 3′端合成亚基因组RNA3，含两个开放阅读框编码非结构蛋白B1和B2。患病鱼表现为游动行为异常及脑、脊髓和视网膜细胞空泡化与坏死，是该病的主要靶器官，给地中海地区主要养殖鱼类造成重大经济损失。

依据RNA2片段T4序列，β诺达病毒分为RGNNV、SJNNV、BFNNV和TPNNV四个基因型，地中海地区仅检出RGNNV和SJNNV，此外还从多种鱼类中分离或检测到SJNNV/RGNNV和RGNNV/SJNNV（RNA1/RNA2）两种片段组合的重配型病毒。已有大量易感鱼类报道，包括欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）、金头鲷（Sparus aurata）、塞内加尔鳎（Solea senegalensis）和石斑鱼（Epinephelus spp.）等经济物种。但不同基因型对特定宿主的毒力并不相同：RGNNV对舌齿鲈高致病，而RGNNV/SJNNV和SJNNV分离株在该鱼种中致死率很低；相反，SJNNV和RGNNV/SJNNV对塞内加尔鳎和鲷则高致病。这种跨宿主疾病严重程度的差异，凸显了开展毒力、感染机制及宿主反应调控比较分析的重要性。

斑马鱼（Danio rerio）幼鱼作为病毒病体内研究模型具有公认优势，尤其适用于研究适应性免疫系统发育（受精后4–6周）之前的抗病毒先天免疫应答，已被用于多种人和鱼类病毒感染建模。幼鱼体型小、透明，便于药物筛选和抗病毒化合物评价。由于水产养殖缺乏许可的抗病毒药物，开发有效抗病毒策略是产业重点与难点，斑马鱼可提供有价值的评价平台。此前已有利用RGNNV基因型建立斑马鱼NNV感染模型的报道，可产生有效感染、激活IFN应答并呈剂量、接种途径和发育阶段依赖的死亡率，且可重现舌齿鲈RGNNV病理（中枢神经系统组织病理损伤和游动异常），但其他NNV基因型迄今未在斑马鱼中测试。

### 研究内容与结论

本研究以斑马鱼为模型，比较其对RGNNV、SJNNV和RGNNV/SJNNV分离株的易感性，并结合鱼类活体成像与分子生物学技术表征各分离株的毒力和早期宿主免疫应答。研究得出：斑马鱼幼鱼对三种β诺达病毒均易感，RGNNV为毒力最强分离株；分离株毒力差异似与炎症反应相关，低毒力分离株RGNNV/SJNNV和SJNNV诱导的炎症反应低于RGNNV；RGNNV浸泡感染及注射试验中炎症反应亦低，且未导致死亡或症状，进一步支持炎症在VER结局中的重要作用。结果支持斑马鱼作为研究β诺达病毒-宿主相互作用的模型，并提示需进一步研究上述差异的机制，以助力开发提高养殖鱼类抗病毒感染能力的有效措施。

### 关键技术方法

研究使用E11细胞系扩增病毒（RGNNV株SpDl_IAusc965.09源自舌齿鲈；SJNNV参考株SJ93Nag源自条纹鲹Pseudocaranx dentex；RGNNV/SJNNV分离株源自鲷），以50%组织培养感染剂量法（TCID50）滴定。采用野生型AB系斑马鱼：受精后3天（dpf）幼鱼经颅内注射（50 TCID50/尾）接种，按病毒最适温度22℃（SJNNV）或25℃（RGNNV及RGNNV/SJNNV）分组并设相应温度对照组；另开展RGNNV浸泡感染（5×10⁶ TCID50/mL）及60 dpf幼鱼肌肉注射（10⁵ TCID50/g）实验。通过绝对qPCR定量病毒RNA2，qPCR检测IFN I、凋亡及炎症相关基因转录（2^?ΔΔCt法，以actb1为内参）；利用Tg(mpx:GFP)i114转基因幼鱼行荧光成像并以Fiji宏程序定量中性粒细胞分布。

### 研究结果

**3.1 斑马鱼幼鱼对RGNNV、RGNNV/SJNNV和SJNNV的易感性**：通过颅内注射后逐日监测临床症状与死亡率，三种病毒接种组自1 dpi起均出现水肿，对照组未见；RGNNV组水肿最显著，自2 dpi起约40%个体受累并达平台期，而RGNNV/SJNNV和SJNNV组分别不超过3%（1尾）和10%，且随时间无进展；重配型组自3 dpi起3%个体出现躯体弯曲。死亡仅见于RGNNV组（1–4 dpi上升）及程度较轻的SJNNV组，累积死亡率分别为14%和6%。病毒基因组定量显示三组RNA2拷贝数自0至4 dpi均显著增加，表明三种分离株均能在幼鱼中复制；RGNNV和RGNNV/SJNNV组持续增加，SJNNV组1至4 dpi无显著增加，且RGNNV组平均拷贝数最高，提示其复制水平最高。

**3.2 颅内感染幼鱼的免疫应答**：通过1和4 dpi转录分析，RGNNV和RGNNV/SJNNV组在两个时间点均显著上调IFN I刺激基因（mxa、isg15、rtp3、irf3），SJNNV组仅4 dpi较低程度上调；凋亡标志casp8和casp9仅4 dpi在各感染组显著上调，ctsl1a仅在RGNNV组4 dpi显著上调。炎症方面，RGNNV组仅4 dpi显著上调il1b、tnfa和il8；RGNNV/SJNNV组4 dpi诱导tnfa和il6；SJNNV组tnfa在1和4 dpi均诱导，il6仅4 dpi诱导。通过Tg(mpx:GFP)转基因幼鱼荧光成像，发现静息状态下中性粒细胞主要位于尾部造血组织及全身巡逻的散在细胞；RGNNV及程度较轻的RGNNV/SJNNV接种在1 dpi引起头部（p值分别为0.001和0.035）和头肾（p值0.01和0.017）显著中性粒细胞招募，4 dpi未见差异；SJNNV组未见中性粒细胞重分布，与对照相似。综上，RGNNV与RGNNV/SJNNV诱导相似的IFN I和凋亡应答，SJNNV激活较弱；RGNNV诱导更强炎症反应及中性粒细胞招募。

**3.3 RGNNV浸泡感染幼鱼**：通过浸泡途径感染，RNA2拷贝数自0至2 dpi轻度但显著增加，未见死亡或症状；6 dpi时IFN I通路及凋亡基因明显上调，但与同株颅内注射不同，各时间点炎症基因均未显著诱导。

**3.4 RGNNV肌肉注射感染幼鱼**：通过肌肉注射，至6 dpi未见死亡或症状，头部RNA2拷贝数随时间无显著增加，提示无病毒复制；rtp3和irf3在1 dpi明显诱导、随后下降并于6 dpi出现第二峰；casp8和ctsl1a仅在1 dpi短暂显著诱导；炎症基因tnfa和il1b在6 dpi显著上调。

### 讨论与结论

讨论指出，三种分离株均能复制并产生症状，表明幼鱼对三者均易感，尽管SJNNV复制在4 dpi似受控制、RGNNV/SJNNV症状比例低；SJNNV接种幼鱼死亡发生于病毒复制趋稳之时，提示早期复制阶段损伤持续进展终致死亡，研究者倾向将其与仅见于SJNNV组1 dpi的极早且强烈（FC>5000）的tnfa诱导相联系。据知这是首次报道斑马鱼幼鱼对RGNNV/SJNNV和SJNNV易感。RGNNV死亡率、症状比例及复制水平最高，为最强毒力分离株；与本研究中4 dpi 2.4%死亡率相比，Lama等报道同途径同鱼龄10 dpi死亡率为44%，本研究因聚焦早期感染动态预设4 dpi终点，长期效应有待延长终点研究。临床征象方面，此前未见NNV感染幼鱼躯体弯曲或水肿报道；躯体弯曲与中枢管、Reissner纤维、室管膜下器官分泌活动、纤毛病、炎症、氧化应激、脑脊液流（CFF）异常及神经退行性变等相关，近期被统一于神经管室管膜单个纤毛本体感受器官的CFF机械感受系统；本研究新增重配型RGNNV/SJNNV颅内感染这一躯体弯曲诱因，可能与其存在于脑脊液影响纤毛室管膜器官有关，但发生频率低。

关于免疫通路，RGNNV触发早期IFN I应答（mxa、isg15、rtp3、irf3），随后上调多数凋亡和促炎细胞因子（casp8、casp9、tnfa、il1b、il8），与其他易感鱼种及斑马鱼既往报道一致。RGNNV与RGNNV/SJNNV组IFN I和凋亡基因诱导模式相似，仅rtp3在后者4 dpi延迟但更强；两组irf3强应答（FC>200,000）可能与凋亡基因相似诱导有关，因IRF3除诱导I型ifn转录外亦刺激凋亡；rtp3强应答与既往irf3和rtp3转录强相关及β诺达病毒感染后rtp3快速强诱导的报道一致，本研究浸泡和肌肉注射试验亦记录到该相关性，提示该基因在NNV-斑马鱼互作中可能同样关键。SJNNV组IFN I和凋亡基因上调则低得多。炎症方面，SJNNV组tnfa和il6轻度诱导，RGNNV/SJNNV组同样低诱导，而RGNNV组4 dpi促炎基因诱导更高；低炎症诱导可能与SJNNV和RGNNV/SJNNV低毒力有关，因温和炎症反应与VER无死亡和无症状相关；中性粒细胞动态分析显示1 dpi RGNNV组头部迁移高于RGNNV/SJNNV组，符合中性粒细胞作为首批到达感染部位免疫细胞的作用。因此，三种病毒毒力差异可能与炎症反应相关，炎症先由中性粒细胞招募驱动，后由促炎基因诱导驱动；免疫控制与免疫逃逸或过度反应（即过度炎症）之间的平衡是病毒感染严重程度的关键。

病毒基因组层面，SJNNV与RGNNV及RGNNV/SJNNV在RNA1片段存在差异，该片段编码参与拮抗活性和宿主细胞死亡的B1和B2蛋白，其拮抗能力差异可能解释IFN I应答诱导水平的不同；RGNNV与后两者在编码CP的RNA2片段存在差异，C端突出域两个氨基酸是RGNNV对塞内加尔鳎、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和欧洲舌齿鲈毒力的重要决定因素，鉴于RGNNV在斑马鱼中毒力最强，CP可能是该物种VER结局的关键决定因素，这也是与舌齿鲈β诺达病毒感染的另一共同点。浸泡感染虽无死亡，但2 dpi病毒基因组显著增加、6 dpi开始下降，恰在IFN I和凋亡基因轻度上调（rtp3诱导最强）之时，且未见炎症基因诱导，再次提示低或无炎症与感染控制密切相关。肌肉注射幼鱼头部检出RGNNV基因组但无复制，说明病毒自注射部位迁移至中枢神经系统而未复制；1 dpi IFN I（rtp3、irf3）和凋亡（casp8、ctsl1a）基因快速上调，rtp3诱导最强（FC 510），6 dpi仅轻微诱导tnfa和il1b；体型是β诺达病毒易感性的相关因素，与Lama等3 dpf肌肉注射死亡而14 dpf无死亡的报道一致。

研究结论译文：总之，斑马鱼幼鱼对所评价的三种β诺达病毒均易感，其中RGNNV为毒力最强分离株。分离株毒力差异似与炎症反应相关，与RGNNV感染相比，低毒力分离株RGNNV/SJNNV和SJNNV接种后炎症反应较低。实际上，RGNNV浸泡和RGNNV注射试验后亦记录到低炎症反应，且未导致死亡或症状，进一步支持炎症在VER结局中的相关作用。这些结果支持斑马鱼作为研究β诺达病毒-宿主相互作用模型的潜力，并促使进一步研究以揭示所观察差异的原因，从而有助于开发提高养殖鱼类抗病毒感染能力所亟需的有效措施。