基于韧皮部特异表达dsAgEcR2的转基因枸杞介导RNAi显著抑制枸杞专化型棉蚜存活与繁殖

《Pest Management Science》：RNA interference of the ecdysone receptor gene AgEcR in a wolfberry - specialized strain of Aphis gossypii Glover affects its survival and fecundity and confers resistance in transgenic goji (Lycium barbarumL.)

　　

背景：蜕皮激素受体（ecdysone receptor, EcR）对昆虫蜕皮、变态和繁殖至关重要，并已在多种昆虫中验证为有效的RNA干扰（RNA interference, RNAi）靶标。然而，其在该枸杞专化型棉蚜（wolfberry-specialized strain of Aphis gossypii Glover）中的RNAi潜力仍未知。研究人员旨在从该蚜虫中分离EcR直系同源基因，筛选有效双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）片段，并在转基因枸杞（Lycium barbarum L.）中验证植物介导RNAi。
结果：AgEcR转录本主要富集于四龄若虫体壁。在五种分别掺入人工饲料进行饲喂测定的体外合成AgEcR-dsRNA片段中，dsAgEcR2表现出最高致死效力，第8天死亡率>88.15%、靶基因抑制>96.06%。饲喂3天后转移至易感寄主，沉默效应至少持续12天，期间成虫寿命、繁殖期和后代产量显著降低。在韧皮部特异性启动子驱动下表达dsAgEcR2的转基因枸杞株系均导致显著蚜虫死亡和繁殖受损——在实验室条件下该水平将严重抑制种群增长。
结论：本研究确立AgEcR为控制A. gossypii的关键靶标，并确定靶向D/E结构域连接区（D/E domain junction）的dsAgEcR2为最强沉默触发物。研究人员还提供从人工饲料筛选到植物介导验证的完整流程，证明枸杞介导RNAi有效抑制蚜虫存活和繁殖。该方法为可持续蚜虫治理提供实用且环境友好策略。? 2026 作者。Pest Management Science 由 John Wiley & Sons Ltd 代表 Society of Chemical Industry 出版。

研究背景：枸杞（Lycium barbarum L.）是中国西北重要经济作物，内蒙古为主要产区之一。枸杞生产长期受蚜虫危害，其中枸杞专化型棉蚜（Aphis gossypii Glover）为优势种，占总体危害的87%。蚜虫以刺吸式口器取食汁液并传播病毒，导致叶片卷曲，降低果实品质和产量。当前防治主要依赖化学杀虫剂，但过度依赖加速抗药性种群发展，并对非靶标生物和生态环境构成风险；全球已记录1000多例蚜虫抗性，约20种主要蚜虫表现高水平抗性。由于枸杞抗蚜种质稀缺及蚜虫-植物互作机制复杂，常规育种突破有限。RNA干扰（RNA interference, RNAi）通过转基因植物表达双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）为害虫防治提供新途径；植物介导RNAi已在蚜虫防治中显示潜力，但针对枸杞专化型棉蚜的应用尚未充分开展。蜕皮激素受体（ecdysone receptor, EcR）是昆虫蜕皮和变态的核心调控因子，属于核受体超家族，作为配体依赖转录因子与Ultraspiracle（USP）形成异二聚体；其包含N端A/B域、高度保守DNA结合域（C域）、铰链区（D域）和配体结合域（E域）。EcR已在多种昆虫中验证为有效RNAi靶标，但同一基因在近缘种间RNAi效率差异很大，且多数蚜虫RNAi研究局限于人工饲料测定，向植物介导系统转化有限。因此，研究人员从该蚜虫中分离EcR直系同源基因AgEcR，表征表达谱，设计5个dsRNA片段筛选最有效干扰片段，并用转基因枸杞介导RNAi验证防效，为AgEcR靶向RNAi防控提供理论和实践基础。
关键技术与方法：研究人员以采自内蒙古枸杞种植区的枸杞专化型棉蚜为材料，在Lycium chinense Miller上饲养并建立单克隆系；植物材料包括易感品种L. chinense Miller和主栽品种Lycium barbarum L. ‘Ningqi-1’，种植于内蒙古林业科学院树木园，室内实验用同一母株扦插。关键技术包括：克隆AgEcR编码序列（coding sequence, CDS）并进行系统发育和脱靶分析；用定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）分析不同发育阶段和组织表达谱；设计5个体外合成dsRNA片段，经人工饲料饲喂筛选；短暂饲喂后转移至易感L. chinense评价持续RNAi；构建pCoYMV（Commelina yellow mottle virus来源韧皮部特异性启动子）驱动dsAgEcR2的植物RNAi载体，转化‘Ningqi-1’枸杞，经Southern blot、Northern blot和qPCR鉴定；在转基因株系上测定蚜虫存活、寿命、繁殖和生命表参数。
研究结果：（1）AgEcR基因的分离与序列特征（Isolation and sequence characterization of the AgEcR gene）：研究人员克隆获得AgEcR全长CDS 1812 bp，与NCBI RefSeq模型XM_050206858.1核苷酸一致性>99.88%；蛋白604个氨基酸，具A/B、C、D、E四个经典结构域，未鉴定到F域。系统发育分析显示AgEcR位于蚜科分支，与豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum (Harris)）和桃蚜（Myzus persicae (Sulzer)）EcR最近。脱靶分析显示其CDS对枸杞、人及主要天敌无连续21个核苷酸完美匹配。结论：AgEcR为典型EcR直系同源基因，脱靶风险极低。
（2）AgEcR基因表达谱分析（Expression profile analysis of the AgEcR gene）：qPCR显示AgEcR在四龄若虫表达最高，分别较三龄若虫和无翅成虫高约6.49倍和8.23倍（P<0.01, n=3），在二龄若虫和有翅成虫最低；四龄若虫组织表达中体壁富集，较中肠高约6.32倍（P<0.01, n=3）。结论：AgEcR在四龄若虫体壁高表达。
（3）dsRNA片段设计及其对蚜虫死亡率和靶基因表达的影响（Design of dsRNA fragments and their effects on aphid mortality and target gene expression）：设计5个覆盖不同结构域的dsRNA片段，以10 ng/μL加入人工饲料饲喂三龄若虫，dsGFP和空白饲料为对照。Kaplan-Meier存活分析显示所有dsAgEcR处理均显著降低存活（P<0.01, n=3）；dsAgEcR2致死最强，第8天存活率降至11.85%（死亡率88.15%），对照存活率>80%。qPCR显示第2天各处理AgEcR表达显著降低，抑制率47.36%–82.86%，dsAgEcR2最强（降至对照17.14%，抑制82.86%）；第8天dsAgEcR2组降至对照3.94%，抑制率96.06%。沉默早于存活下降，支持致死效应源于靶基因下调。结论：dsAgEcR2为最有效沉默片段。
（4）短暂饲喂后的持续RNAi效应（Persistent RNAi effect after transient feeding）：三龄若虫饲喂dsAgEcR2 3天后转移至易感L. chinense，观察12天。dsAgEcR2组存活率显著低于对照（P<0.01, n=3），第12天降至41.67%，对照为93.33–98.33%；qPCR显示沉默持续至蚜虫死亡。存活蚜虫成虫寿命、繁殖期、每日繁殖量和总后代产量显著降低；成虫寿命和繁殖期几乎减半，总后代产量较dsGFP对照下降约61.17%（P<0.05, n=3）。结论：单次dsRNA饲喂触发的RNAi至少持续整个成虫寿命。
（5）转基因枸杞的获得与分子鉴定（Generation and molecular identification of transgenic goji）：构建pCambia2301-pCoYMV:dsAgEcR2载体，以韧皮部特异性pCoYMV启动子驱动发夹RNA表达，转化L. barbarum ‘Ningqi-1’叶外植体，获得再生植株。Southern blot和Northern blot分别确认单拷贝转基因整合和dsRNA表达；qPCR显示4个株系（goji-15、goji-19、goji-25、goji-28）dsRNA表达水平不同，goji-28最高，较goji-25高1.67倍，goji-15和goji-19较低且二者无显著差异，但均与goji-25显著不同（P<0.05）。结论：获得表达dsAgEcR2的单拷贝转基因枸杞株系。
（6）植物介导RNAi对蚜虫寿命、繁殖和种群增长的抑制作用（Inhibitory effect of plant-mediated RNAi on aphid longevity, fecundity, and population growth）：将同步一龄若虫单头饲养于转基因株系和空载体（empty vector, EV）对照。转基因植株生长旺盛、蚜虫聚集少，对照受害重；部分取食转基因株系的蚜虫出现蜕皮困难和表皮凹陷。存活曲线显示转基因株系上蚜虫存活显著降低（P<0.01, n=3），goji-28第12天死亡率>80.00%；四龄若虫AgEcR表达在四个转基因株系上均显著降低（P<0.01, n=3）。与对照相比，goji-28使成虫寿命降低83.74%、每日繁殖量降低70.10%、总后代产量降低90.59%（P<0.01, n=3）；goji-25使成虫寿命降低57.01%、每日繁殖量降低48.80%、总后代产量降低72.78%（P<0.01, n=3）。生命表分析显示goji-28使净生殖率（R₀）降至对照10.45%，显著降低内禀增长率（r_m）和有限增长率（λ），并显著延长种群加倍时间（t）（P<0.01, n=3）。结论：AgEcR沉默同时抑制个体存活繁殖和种群快速扩张能力。
讨论部分总结：研究人员系统评价了AgEcR在枸杞专化型棉蚜中的RNAi潜力，并通过转基因枸杞验证转化应用。AgEcR下调与死亡的时间相关性及存活曲线下降支持其生存必需性。EcR已被多项研究证实为致死RNAi靶标，禾谷缢管蚜和棉蚜甜瓜专化型中植物介导EcR沉默也抑制存活繁殖；融合dsRNA和水平转移基因等策略增强半翅目害虫RNAi可行性。5个片段中dsAgEcR2（D/E连接区）沉默效率最高；靶向C域的dsAgEcR1效果较差；较长C–E片段dsAgEcR5未增效，提示RNAi效率不仅取决于长度，还受局部RNA结构可及性影响，过长dsRNA可能因复杂二级结构干扰Dicer（一种dsRNA加工酶）加工，该假设尚需RNA二级结构预测或生化可及性实验验证。dsAgEcR2饲喂产生强抑制并使转基因枸杞上蚜虫出现表皮凹陷，提示部分摄入dsRNA逃逸唾液核酸酶进入循环系统触发系统RNAi；体壁为蜕皮直接位点，表皮凹陷可能与AgEcR功能缺失相关。转基因植物可持续供应dsRNA，克服瞬时干扰时限。局限性包括：人工饲料仅用单一浓度10 ng/μL；持续RNAi分子机制未明，未直接检测dsRNA/小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）持久性；脱靶风险仅基于序列同源评估；转基因表达水平和插入位点/位置效应未确定。田间应用尚需解决dsRNA环境稳定性、高效低成本递送和RNAi转基因作物监管与生物安全评价。
研究结论翻译：本研究从枸杞专化型棉蚜中克隆并表征蜕皮激素受体基因AgEcR，并系统评价其RNA干扰潜力。在人工饲料饲喂测定的5个体外合成AgEcR-dsRNA片段中，dsAgEcR2致死效力最高，第8天死亡率>88.15%、靶基因抑制>96.06%，沉默效应至少持续12天。利用韧皮部特异性pCoYMV启动子驱动dsAgEcR2表达，研究人员获得4个单拷贝转基因枸杞株系，其中最优株系goji-28使成虫寿命降低83.74%、繁殖力降低90.59%，净生殖率（R₀）降至对照10.45%。结果表明，沉默AgEcR有效抑制蚜虫个体存活和繁殖，并显著遏制种群增长。总体而言，本研究为A. gossypii可持续治理提供环境友好策略，并支持RNAi技术在园艺害虫防治中的更广泛应用。