适度超声增强薏苡仁籽多酚抗炎活性及其经PI3K-Akt通路和肠道菌群缓解DSS诱导结肠炎的机制研究

《Ultrasonics Sonochemistry》：Effects of ultrasound on the component, anti-inflammatory activity of adlay seed polyphenols and the mechanism of alleviating colitis

　　

采用超声辅助提取（UAE）制备薏苡仁籽多酚提取物（ASP），并通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）和细胞炎症模型评价超声强度对ASP组成及体外抗炎活性的影响。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎小鼠中进一步验证在最佳超声功率下获得的ASP的抗结肠炎机制。共鉴定出ASP中14种主要酚类化合物。300 W中等强度超声使ASP酚类成分显著增加61.01%，主要为山柰酚（kaempferol）、阿魏酸（ferulic acid）和松柏醇（coniferyl alcohol），并增强其抗炎生物活性。在DSS诱导小鼠中，ASP干预维持肠道屏障完整性，抑制促炎细胞因子并促进抗炎细胞因子分泌。16S rRNA测序进一步显示，ASP通过降低促炎性Escherichia-Shigella（57.14%）和Bacteroides（45.83%）并富集有益Lachnospiraceae_NK4A136_group（68.49%）恢复肠道微生物稳态，支持基础代谢功能和肠上皮修复的恢复。转录组分析和定量聚合酶链反应（qPCR）验证证实，ASP通过抑制PI3K-Akt信号通路异常激活缓解结肠炎。综上，UAE增强了ASP的抗炎生物活性，为其在结肠炎干预中的开发与应用提供依据。

Yue Wu等围绕超声调控薏苡仁籽多酚（adlay seed polyphenols）组成及其缓解结肠炎的作用开展研究。炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）为慢性、复发性和难治性胃肠道炎症性疾病，常伴肠道炎症、黏膜损伤和吸收不良，并可增加肠纤维化、肠梗阻乃至结直肠癌等并发症风险；现有抗生素、糖皮质激素、柳氮磺吡啶和5-氨基水杨酸等治疗仍存在疗效有限、耐受性差和不良反应等问题。植物多酚因生物安全性高、低毒和多靶点调节而成为IBD辅助干预研究热点，其核心机制涉及肠道菌群调节和炎症信号通路调控。薏苡仁籽富含酚类化合物，但谷物多酚多以结合型存在，传统提取效率低、能耗高，超声辅助提取（ultrasound-assisted extraction，UAE）可通过空化与机械振动破坏细胞壁、促进结合态多酚释放，然而超声处理与ASP抗炎活性及缓解结肠炎能力之间的系统研究仍有限。基于此，研究人员制备ASP，评价不同超声强度对酚类组成和体外抗炎活性的影响，并选用最佳超声功率所得ASP在DSS诱导结肠炎小鼠中验证其作用及机制。研究结论表明，适度超声可提高ASP酚类含量和抗炎活性，ASP可维护肠道屏障、调节细胞因子、重塑肠道菌群并抑制PI3K-Akt信号通路，从而缓解结肠炎；该研究为薏苡仁籽多酚在结肠炎干预中的功能食品或天然药物开发提供了科学依据。论文发表在《Ultrasonics Sonochemistry》。

关键技术方法（≤250字）：薏苡仁籽样本由山西东方亮生物科技有限公司提供；雄性C57BL/6J小鼠购自辽宁长生生物科技有限公司，动物实验经中国农业科学院生物伦理委员会批准（250808–04-GR）。研究采用UPLC-QTOF-MS和UHPLC-DAD鉴定与定量酚类成分；以LPS刺激RAW264.7细胞建立炎症模型，检测氧化应激、LDH及细胞因子；采用DSS诱导C57BL/6J小鼠结肠炎，结合H&E染色、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测紧密连接蛋白；通过16S rRNA测序、LEfSe和PICRUSt2分析菌群及功能预测；以GC-MS测定短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）；并以RNA-seq、GO/KEGG富集和qRT-PCR验证关键通路。

研究结果如下。3.1 超声处理对薏苡仁籽酚类化合物的影响（Effect of ultrasonic treatment on phenolic compounds in adlay seed）：通过UPLC-QTOF-MS鉴定出14种主要酚类化合物，包括5种酚酸、7种黄酮和2种其他多酚；UHPLC-DAD定量显示，与未处理组相比，各超声功率均显著提高总多酚含量，增幅为17.65%—61.01%，其中300 W组最高，超过600 W后下降；300 W下山柰酚、阿魏酸和松柏醇分别增加92.59%、80.01%和81.84%，柚皮素、阿魏酸和丁香醛绝对含量分别达119.59±10.31、68.69±4.21和66.15±4.14 mg/100 g，提示适度超声有利于酚类释放，过高功率则导致含量下降。3.2 超声处理对薏苡仁籽多酚提取物体外抗炎活性的影响（Effect of ultrasonic treatment on the anti-inflammatory activity of adlay seed polyphenol extracts）：通过LPS诱导细胞炎症模型发现，ASP剂量依赖性降低ROS、MDA和LDH释放，提高SOD和GSH-Px活性，抑制TNF-α、IL-6和IL-17分泌并促进IL-4、IL-10和TGF-β₁分泌；相同剂量下超声处理ASP优于未超声ASP，300 W组效果最明显，600 W组略降；高剂量300 W ASP较未超声ASP进一步降低ROS、MDA和LDH，并提高SOD和GSH-Px活性，表明适度超声增强ASP抗炎和抗氧化能力。3.3 薏苡仁籽多酚提取物对结肠炎小鼠症状的影响（Effects of adlay seed polyphenol extracts on symptoms in colitis mice）：通过5% DSS诱导小鼠结肠炎并以50、150和450 mg/kg ASP干预，结果显示ASP减轻体重下降、降低DAI评分、缓解脾肿大和结肠缩短，并改善H&E染色所示黏膜损伤、隐窝紊乱和炎症浸润；高剂量ASP的疗效与5-ASA阳性对照组无统计学差异。3.4 薏苡仁籽多酚提取物对结肠炎小鼠肠道屏障和炎症因子的影响（Effects of adlay seed polyphenol extracts on the intestinal barrier and inflammatory factors in colitis mice）：通过IHC和ELISA发现，模型组ZO-1、Occludin和Claudin-1显著下降，促炎IL-17、IL-6和TNF-α升高，抗炎IL-4、IL-10和TGF-β₁降低；ASP干预剂量依赖性上调紧密连接蛋白，抑制促炎因子并促进抗炎因子，提示ASP可恢复肠道屏障完整性并逆转炎症失衡。3.5 薏苡仁籽多酚提取物对结肠炎小鼠肠道菌群的调控作用（Regulatory effects of adlay seed polyphenol extracts on the gut microbiota of colitis mice）：通过16S rRNA测序发现，DSS降低菌群多样性并改变门、属水平组成，模型组Bacillota（原Firmicutes）下降、Bacteroidota（原Bacteroidetes）和Pseudomonadota（原Proteobacteria）升高，Escherichia-Shigella和Bacteroides富集、Lachnospiraceae_NK4A136_group减少；ASP提高菌群多样性，恢复F/B比值，降低Escherichia-Shigella、Bacteroides和norank_f__Muribaculaceae，增加Lachnospiraceae_NK4A136_group，并提高乙酸、丁酸、丙酸和异丁酸水平；LEfSe和PICRUSt2提示ASP重塑菌群结构并影响基础代谢、上皮修复及致病性相关功能。3.6 薏苡仁籽多酚提取物缓解结肠炎的信号通路（Adlay seed polyphenol extracts alleviates colitis signaling pathways）：通过RNA-seq、GO/KEGG富集和qRT-PCR验证发现，ASP干预影响结肠炎小鼠结肠基因表达，差异基因富集于免疫反应、细菌防御、吞噬、TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用及PI3K-Akt信号通路；qRT-PCR显示模型组PI3K、Akt和mTOR mRNA升高，ASP-H组显著降低，并逆转TSC2、p70S6k、4EBP1、Beclin-1和LC3B等mTOR轴相关基因异常，表明ASP通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路异常激活缓解结肠炎。

讨论部分总结：研究人员鉴定出ASP中14种酚类化合物，并指出超声处理使山柰酚、阿魏酸和松柏醇增幅最大；由于ASP为复杂粗提物，观察到的生物学效应应归因于ASP整体，但不能排除其他共提取成分的贡献，既有证据支持多酚为主要活性成分。超声功率可显著调控ASP多酚含量和抗炎活性，150—300 W范围内随功率升高空化与机械振动增强，促进酚类释放，300 W为最佳；600 W过高能量可导致活性成分结构损伤、氧化降解和生物稳定性下降，从而降低抗炎活性。DSS模型验证了ASP减轻体重下降、DAI评分、结肠缩短和组织病理损伤，并恢复紧密连接蛋白及促炎/抗炎细胞因子平衡。肠道菌群分析表明ASP降低Escherichia-Shigella和Bacteroides等有害菌、增加Lachnospiraceae_NK4A136_group，修复黏膜屏障并抑制炎症循环；PICRUSt2功能预测提示其恢复基础代谢和上皮修复相关功能并抑制微生物致病性相关通路。转录组和qRT-PCR结果支持PI3K-Akt通路为ASP抗结肠炎的关键中介之一，并与TNF、IL-17、NF-κB和JAK-STAT等炎症轴存在联系；但研究未在蛋白水平验证PI3K/Akt/mTOR通路，也不能排除ASP对这些炎症途径的直接作用，后续需专门机制实验及粪菌移植研究。

研究结论（译）：本研究结果表明，超声处理有效提高了ASP中酚类化合物的得率，尤其是山柰酚、阿魏酸和松柏醇，从而赋予ASP增强的抗炎生物活性。此外，ASP显著减缓结肠炎小鼠体重下降，减轻DAI评分升高，改善结肠缩短，并减少结肠组织病理损伤。ASP可通过增加结肠紧密连接蛋白丰度增强肠道屏障完整性。此外，ASP干预通过下调促炎IL-17、IL-6和TNF-α并上调抗炎IL-4、IL-10和TGF-β₁，逆转结肠炎小鼠的炎症失衡，最终对炎症肠道发挥保护作用，表明其增强肠道屏障功能并改善炎症状态。16S rRNA测序结果显示，ASP治疗增加肠道菌群多样性，促进有益菌（如Lachnospiraceae_NK4A136_group）生长，并抑制Escherichia-Shigella和Bacteroides等潜在病原菌增殖。功能预测分析表明，ASP恢复与微生物基础代谢和上皮细胞修复相关的功能，同时影响与微生物致病性相关的功能。机制研究表明，ASP有效抑制PI3K-Akt信号激活。该发现为开发基于薏苡仁籽的天然药物或功能食品用于结肠炎治疗提供了科学依据。应注意，这些作用代表ASP的综合作用，其中多酚是主要已鉴定生物活性成分，关键信号通路的蛋白水平验证将在未来研究中开展。本研究指出若干需要探索的领域，包括评估ASP与其他药物的比较效应及阐明ASP的治疗机制；未来研究应通过粪菌移植评估ASP对肠道菌群的调控机制。