高密度灌流培养在一次性生物反应器中的传质挑战：氧与二氧化碳平衡的规模化瓶颈

《Biotechnology Progress》：Challenges in meeting the mass transfer demands of high-density perfusion cultures in single-use bioreactors

　　

通过采用强化灌流培养来增加蛋白质治疗药物的产量，对一次性生物反应器（SUB）的传质能力提出了很高的要求。本研究比较了四种SUB设计在支持中国仓鼠卵巢（CHO）灌流培养时最严苛氧气（O2）转移需求方面的能力。研究表征了功率耗散、气体流速、O2富集、二氧化碳分压（pCO2）和鼓泡孔径对O2和CO2传质（氧传质速率OTR和二氧化碳传质速率CTR）的影响。在50 L和1000 L规模下，仅有一种设计能够在单鼓泡器条件下，以100×106 viable cells/mL的细胞密度支持最严苛细胞系的O2供应并有效去除CO2。另外三种设计的更大规模版本也经过了测试。对于任何设计而言，50 L规模下的性能均无法预测大规模（200 L或1000 L）下的性能。研究表征了气体在反应器内停留期间体积和组成的变化，结果发现变化显著。研究人员假设呼吸商为1，在设计空间内计算了预测的培养pCO2值，构建了预测培养pCO2的响应面，并用于考察各种提高OTR策略的后果。大多数策略会不成比例地提高OTR相对于CTR的比值，从而导致培养pCO2升高。本文讨论了这些发现对高强度灌流培养中SUB设计和规模放大的启示。

高密度灌流培养在一次性生物反应器中的传质挑战：研究解读

一、研究背景与意义

生物制药行业传统上采用大规模不锈钢生物反应器通过分批补料（fed-batch）方式生产蛋白质药物，但此类设施资本支出和运营成本高昂。一次性生物反应器（SUB）因成本优势在小规模生产中已广泛替代不锈钢反应器。为进一步降低生产成本，许多公司正探索灌流培养（perfusion culture）技术。与分批补料相比，灌流培养可显著提高活细胞密度（VCC）并延长工艺持续时间，但这也对反应器的传质能力提出了更高要求。高密度灌流培养需要更高的氧摄取速率（OUR），因此氧传质速率（OTR）必须至少等于培养物的OUR以防止缺氧；同时，CO₂积累会抑制细胞生长、蛋白质产量和糖基化谱，因此二氧化碳传质速率（CTR）必须与CO₂产生速率相匹配。传统传质理论假设气体在液相停留期间体积和组成变化极小，但在强化哺乳动物细胞培养中，高OUR促使SUB设计者采用O₂富集和减小气泡尺寸，这导致气泡在液相停留期间体积和组成发生显著变化，使传统基于K_La和驱动力计算传质的方法产生严重误差。此外，CO₂与O₂的传质行为存在本质差异：CO₂在水中的溶解度更高，且受碳酸氢盐缓冲体系影响，气泡在数秒内即可达到CO₂平衡，而O₂平衡需数分钟，因此CTR受气相平衡限制而OTR受液膜阻力限制。现有文献中的传质实验多在类水溶液、无CO₂相关物种、以空气为鼓泡气体的条件下进行，与工业强化培养条件差异显著。本研究旨在工业相关条件下系统表征四种SUB设计的OTR和CTR能力，评估其能否满足高密度灌流培养的传质需求。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员对四种来自三家供应商的SUB设计在50 L规模下进行了传质表征，其中三种设计还测试了更大规模（200 L或1000 L）的版本。研究采用动态排气法（gassing-out method）同时测定OTR和CTR，使用分割图实验设计（split-plot experimental design），将初始pCO₂设为难以改变的因素。实验在36.5°C下使用专有的细胞培养模拟液（cell culture mimetic）进行，该模拟液不含细胞，由盐类、缓冲液和表面活性剂组成，用于模拟Lonza专有细胞培养基的离子强度、气泡形成和缓冲能力。OUR通过动态法在10 L玻璃搅拌罐中测定五种GS-CHO细胞系在分批补料培养的生长期（第4天）和稳定期（第11天）的耗氧速率。气泡体积变化通过气相O₂和CO₂的质量平衡计算。培养pCO₂的预测基于呼吸商（RQ）为1的假设，即CTR与OTR在平衡时相等，通过响应面模型反推满足该条件的pCO₂值。

三、研究结果

3.1 氧摄取速率（OUR）

以VCC为基础，支持灌流培养所需的预测OUR范围为14至27 mmol/L/h；以活细胞体积（VCV）为基础，预测OUR范围为15至36 mmol/L/h。多数细胞系在生长期的生物量比活细胞体积比OUR高于稳定期，这归因于细胞尺寸差异——稳定期细胞直径更大，单细胞生物量更高。研究人员采用25 mmol/L/h作为目标OUR（支持100×10⁶ cells/mL的最大预测OUR），36 mmol/L/h作为延伸目标。

3.2 传质速率（OTR和CTR）

在50 L规模单鼓泡器模式下，仅设计4达到了目标OTR₄₀和延伸目标。双鼓泡器模式可提高OTR，设计1和2在双鼓泡器模式下最大可支持的VCC分别为36×10⁶和49×10⁶ cells/mL，预测pCO₂分别为48和59 mm Hg，远低于先进灌流工艺所需的细胞密度。设计3和4在双鼓泡器模式下最大可支持VCC分别为104×10⁶和164×10⁶ cells/mL，预测pCO₂分别为107和101 mm Hg，达到目标VCC要求。设计4在50 L和1000 L规模均支持26% VCV的延伸目标，但1000 L规模下预测pCO₂达147 mm Hg。

3.3 叶轮设计

设计1和2仅下叶轮不同，设计1采用下斜叶桨，设计2采用下Rushton涡轮。设计2的OTR₄₀对功率耗散（P/V）的敏感性远高于设计1。在50 L规模60 W/m³条件下，设计2的OTR₄₀高于设计1，但此优势在200 L规模未保持。

3.4 规模化放大

设计1从50 L放大到200 L时OTR增加，符合预期。但设计2在放大到200 L时OTR₄₀未见增加，与设计1在放大后的表现相反，而两设计唯一差异是下叶轮。设计4使用1000 μm鼓泡器时50 L至1000 L的放大预测良好，但使用50 μm鼓泡器时50 L规模的OTR₄₀显著高于1000 L规模。

3.5 气泡体积变化

设计4的气泡体积变化（Δ_BV）在最严苛条件下可增加70%（高pCO₂时）或减少35%（高O₂富集时）。在设计空间的大部分区域，气泡在离开液相前已饱和CO₂。在某些情况下，气泡内O₂含量降至空气饱和度的47%，而主体液相DOT为40%空气饱和度，表明O₂驱动力下降约90%。Δ_BV随初始pCO₂升高而增加，随O₂富集增加而减少。

3.6 鼓泡孔径

较小的鼓泡孔径产生更小的气泡，具有更大的表面积与体积比，使OTR和CTR均增加，Δ_BV变化更剧烈，响应面更陡峭。

3.7 功率耗散

增加功率耗散同时提高OTR和CTR，使响应面更陡峭。对于50 μm鼓泡器，增加功率耗散时出现向气泡收缩方向的偏移，尤其在1000 L规模，表明OTR的增强大于CTR。

3.8 表观气速（U_g）

增加U_g提高传质但使响应面平坦化，Δ_BV对O₂富集和初始pCO₂的敏感性降低。此效应在50 μm鼓泡器上比1000 μm鼓泡器更显著，可能与微孔鼓泡器表面气泡聚并有关。

3.9 操作规模

从50 L放大到1000 L导致气泡向收缩方向偏移，尤其在较小鼓泡孔径时更明显，表明放大过程中OTR的增强大于CTR。这归因于大规模下气泡停留时间延长和水静压头增加。

3.10 预测pCO₂

减小鼓泡孔径、增加功率耗散、增加O₂富集和增大操作规模均会提高维持OTR与CTR平衡所需的培养pCO₂。U_g对预测pCO₂相对不敏感，仅在较高U_g时略有降低。

四、讨论与结论

讨论部分指出，增加K_L（如通过增加功率耗散）、增加O₂驱动力、通过增加气体滞留或减小气泡尺寸来增加界面面积，均会导致培养pCO₂升高。唯一不增加pCO₂的提高OTR途径是增加气体流速而不减小气泡体积。规模化放大时，基于U_g放大导致单位体积气体流量下降，降低CO₂剥离能力，同时需增加O₂富集以维持OTR，进一步加剧CO₂积累。建议在放大时保持单位体积气体流量恒定，并设计足够的鼓泡孔容量和气体出口过滤器面积。下一代SUB设计应遵循以下原则：平衡OTR和CTR需求选择适当的鼓泡孔径和总气体流量；提供更大的气体出口过滤器容量以支持基于单位体积气体流量的放大；避免使用对鼓泡孔间距和气泡聚并控制不佳的烧结鼓泡器；采用传统、表征良好的搅拌罐反应器设计以保证可放大的传质性能。

结论部分指出，在SUB中进行的强化哺乳动物工艺中，传统传质理论的基本假设不再成立——进入和离开反应器的气体体积不同，气体组成也不同。在强化灌流培养条件下，CO₂剥离比低强度工艺中更具挑战性。大多数提高OTR的工艺手段会降低CTR与OTR的比值，从而升高培养pCO₂。在评估的四种SUB中，仅一种达到了支持最严苛细胞系在26% VCV下所需的OTR，且所有提供大规模版本的三种设计均出现放大问题。SUB制造商需要解决这些问题，终端用户应确认其OTR和CTR能力足以满足强化工艺需求，且50 L结果应在目标生产规模下进行验证。