吲哚–腙杂合衍生物作为增强皮肤癌治疗的新兴治疗剂：分子设计、生物学评价与纳米脂质体递送

《RSC Pharmaceutics》：Indole–hydrazone hybrid derivatives as emerging therapeutics for enhanced skin cancer therapy: molecular design, biological evaluation and nanoliposomal deliveryOpen Access

为推进皮肤癌治疗，研究人员通过腙缩合反应合成了一系列吲哚–腙衍生物（5a–5l）。经结构表征后，对这些化合物针对多种人癌细胞系（包括M14、MCF-7、HepG2、HEK-293T和A549）进行了筛选。在该系列中，化合物5l成为最有效的先导化合物，对M14黑色素瘤细胞系表现出优异的抗增殖活性，IC₅₀为0.08 μM。使用流式细胞术进行的机制研究表明，5l成功诱导凋亡并触发G2期细胞周期阻滞。计算研究（包括分子对接和分子动力学模拟）证实了与mTOR结合口袋的合理相互作用以及配体–蛋白复合物的稳健稳定性。为增强治疗活性并实现靶向递送，研究人员开发了负载5l的纳米脂质体凝胶制剂（GEL4）用于体内评估。纳米脂质体凝胶通过增强药物渗透、确保靶向递送并提供持续药物释放，代表了一种有前景的非侵入性皮肤癌治疗方法。共聚焦显微镜和离体皮肤渗透研究证明，所开发的制剂表现出改善的皮肤渗透性和受控的药物释放。体内结果表明，与市售乳膏（5-FU）相比，纳米脂质体凝胶具有增强的抗癌功效。此外，皮肤刺激性研究表明，在所评估的实验条件下未观察到明显的治疗相关毒性，突显了其作为选择性且有效的局部皮肤癌治疗选择的潜力。

皮肤癌是全球最常见的癌症之一，构成重大公共卫生挑战。2020年诊断出超过150万例新发病例，其中黑色素瘤约占325 000例，并导致约57 000例死亡。手术切除仍是黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌的首选标准治疗，手术干预和化疗是目前的主要治疗策略。然而，多药耐药性的不断增加以及传统化疗相关的严重不良反应仍是主要临床挑战，这强调迫切需要开发选择性、更高效且靶向的抗皮肤癌治疗剂。许多抗皮肤癌疗法通过靶向和抑制关键信号网络发挥作用，尤其是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和人表皮生长因子受体2（HER2）等通路。mTOR是一种丝氨酸–苏氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt/磷酸酶信号级联的关键组分，在调节众多哺乳动物细胞过程（包括细胞生长、增殖和存活）中发挥关键作用。近期研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号失调对黑色素瘤发展贡献巨大。杂环化合物因其多样的结构框架而对皮肤癌治疗至关重要，其中含氮杂环——特别是基于吲哚的化合物——因其广泛的药理学应用而受到相当大的研究关注。吲哚类化合物通过涉及蛋白激酶、拓扑异构酶、微管蛋白、凋亡、芳香化酶和表观遗传通路的机制表现出抗癌活性。因此，吲哚和吲哚–杂环杂合物为设计和开发新型抗癌剂提供了强大的药物化学框架。基于研究人员对腙连接吲哚杂合物作为潜在抗癌剂的研究并寻求突破，本研究旨在设计合成一系列新型化合物，预期获得有前景的结果。制备了一系列杂环化合物类似物（5a–5l），并在体外实验中研究了其抗癌特性。基于分析和针对癌细胞系的初步体外筛选，选择了最有效的化合物（5l）用于进一步的体内研究。传统药物递送方法如口服或腹腔给药具有侵入性，且因较高的全身吸收和相关副作用而不太适合治疗浅表肿瘤。脂质基纳米载体被认为是递送药物样性质不佳的候选物的有吸引力的纳米颗粒系统，具有多种药学优势。与近期黑色素瘤纳米医学研究主要关注光响应性纳米载体工程和已建立化疗剂的递送不同，本研究主要由药物化学驱动，聚焦于新型吲哚基腙衍生物（5a–5l）的设计与合成，主要贡献在于这些新化学实体的结构多样化、MTT法筛选以及构效关系见解的产生。此外，所选潜在化合物（5l）随后被 incorporated 到纳米脂质体局部制剂（GEL4）中，为皮肤癌管理提供了更有效和局部化的方法。因此，本研究桥接了药物化学、靶向抗癌评价和纳米脂质体制剂，为进一步优化和制剂开发提供了潜在先导结构。这些凝胶促进具有受控释放动力学的非侵入性药物递送，增强直接在肿瘤部位的药物渗透，同时最小化全身毒性。此外，纳米脂质体凝胶的患者友好应用改善了治疗依从性并简化了治疗监测。总体而言，GEL4代表了靶向皮肤癌治疗的有前景策略，可减少并发症并优化治疗功效。研究人员得出结论：本研究合理设计并合成了一系列12种腙连接吲哚衍生物以评估其抗癌潜力。通过体外MTT法评估其细胞毒性，其中化合物5l（IC₅₀ = 0.08、0.96、3.78、12.56和2.45 μM）对M14、MCF-7、HepG2、HEK293T和A549癌细胞系表现出最有前景的活性。凋亡实验证实5l通过凋亡诱导细胞死亡并通过流式细胞术证明将细胞生长阻滞于细胞周期的G2期。由于5l的强效细胞毒性，选择其进行进一步研究。为实现靶向递送和改善给药，开发了负载5l的纳米脂质体凝胶用于体内生物学评价。为增强化合物溶解度、靶向吸收、渗透性、皮肤滞留、生物利用度和治疗功效，研究人员制备了负载5l的纳米脂质体，然后将其 incorporated 到凝胶基质中以获得更好的滞留性和患者依从性，用于皮肤癌治疗。纳米脂质体凝胶表现出持续和受控释放以防止5l化合物初始突释进入皮肤，使其成为皮肤给药的更安全替代方案。纳米脂质体凝胶的渗透性优于5l混悬液，经共聚焦显微镜和渗透研究证实。皮肤刺激性研究表明化合物5l无刺激性并对癌细胞系表现出优先细胞毒性，在测试实验条件下的组织学研究中未观察到可识别的治疗相关毒性。体内抗癌活性表明负载5l的纳米脂质体凝胶与5-FU乳膏相比表现出显著功效。计算机对接分析证明了5l与mTOR激酶受体相互作用的合理结合模式。随后的分子动力学模拟证实了蛋白–配体复合物的稳定性，支持其作为有前景的抗皮肤癌剂的潜力。总之，这些吲哚连接的腙衍生物代表了进一步优化开发更有效抗癌治疗剂的有价值先导化合物。

研究人员为开展本研究用到的主要关键技术方法包括：通过腙缩合反应合成吲哚–腙衍生物（5a–5l）并进行结构表征（NMR、HRMS、FTIR等）；采用MTT法针对M14、MCF-7、HepG2、HEK-293T和A549细胞系进行体外抗癌筛选；使用流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染和细胞周期分析）评估凋亡和细胞周期；采用Schr?dinger Maestro进行分子对接和100 ns分子动力学模拟；使用HotSpot?激酶放射测定法评估mTOR抑制活性；通过改良乙醇注入法制备负载5l的纳米脂质体并 incorporated 到Carbopol 934凝胶基质中（GEL4）；采用Franz扩散池进行离体皮肤渗透研究；使用DMBA和紫外线辐射诱导的瑞士白化小鼠皮肤肿瘤模型进行体内评价（动物方案批准号1737，Jamia Hamdard机构动物伦理委员会）；以及共聚焦激光扫描显微镜、TEM、FESEM、FTIR、质构分析和稳定性研究等表征手段。

研究结果方面：在化学部分，目标衍生物5a–5l通过三步反应序列合成，纯度经TLC、熔点测定和NMR波谱确认。在光谱分析表征部分，HRMS分析确认观察到的分子离子峰在计算理论质量的±0.04%范围内，IR、¹H NMR、¹³C NMR和质谱分析结果与所合成化合物的分子结构一致，NOESY NMR谱确认了腙的E-异构体。在生物活性评价的体外抗癌活性部分，MTT法显示化合物5l（在亚胺位置引入蒽基团）在所有测试细胞系中表现出最强的抗癌活性（M14、MCF-7、HepG2、HEK-293T、A549的IC₅₀分别为0.08、0.96、3.78、12.56和2.45 μM），其次为含萘基的5c；构效关系表明亚胺位置连接的取代基显著影响细胞毒性，蒽和萘基显著提高细胞毒作用，而苯氧基、2-甲氧基苯基或3,4,5-三甲氧基苯基降低活性。在细胞凋亡研究中，流式细胞术显示5l在2 μM和10 μM浓度下有效触发M14细胞凋亡，10 μM时晚期/继发性凋亡从14.1%增至48.5%。在细胞周期分析中，5l处理导致M14细胞G2期阻滞呈剂量依赖性增加（2 μM和10 μM分别为36.9%和43.5%，对照为5.08%）。在分子预测部分，分子对接显示5l与GLY169形成氢键并与TYR2105残基发生π–π堆积，MMGBSA ΔG结合能为?45.23 kcal mol^?1， glide评分为?8.105 kcal mol^?1；100 ns分子动力学模拟显示5l复合物比共晶配体（雷帕霉素）具有更高的结构稳定性。在mTOR抑制活性部分，HotSpot?激酶测定表明制剂GEL4和化合物5l显示出比雷帕霉素更高的mTOR抑制水平，GEL4对mTOR的IC₅₀为64.2 μM。在构效关系部分，SAR分析表明蒽、萘基、2-氯苯基、2-羟基苯基、吡咯和5-溴噻吩部分的引入对增强活性起关键作用。在纳米脂质体理化表征部分，制备的脂质体尺寸为176.1 ± 2.11 nm，PDI为0.153 ± 0.02，NL3配方（胆固醇25 mg、磷脂50 mg、5l 10 mg）包封率为82.75 ± 2.4%，药物载量为8.71 ± 1.64%，zeta电位为?44.8 ± 0.60 mV。在纳米脂质体凝胶理化表征部分，GEL4平均液滴尺寸为209.2 ± 3.34 nm，PDI为0.189 ± 0.03，zeta电位为?43.35 ± 0.24 mV。在形态学研究部分，TEM显示球形囊泡且无聚集，FESEM显示圆柱形和球形结构，无相分离表明5l有效 incorporated 到凝胶基质中。在FTIR分析部分，5l负载纳米脂质体凝胶中特征峰发生位移，表明形成了新的非共价相互作用如氢键。在凝胶机械强度部分，质构分析显示GEL4硬度为228.26 g力，稠度为1508.32 g s，具有足够的硬度和内聚性。在稳定性研究中，优化纳米脂质体凝胶在室温和2–8 °C下30天内表现出良好稳定性。在体外释放研究中，24 h后纳米脂质体凝胶释放53.5 ± 1.56%，纳米脂质体释放85.02 ± 0.933%，而纯5l在12 h内突释97.11 ± 0.957%。在离体皮肤渗透研究中，GEL4（1193.07 ± 1.05 μg cm^?2）和NL3（1544.56 ± 2.554 μg cm^?2）的渗透量显著高于纯5l混悬液（383.88 ± 0.99 μg cm^?2）。在释放动力学部分，Higuchi矩阵模型R²值最高（0.9583），n值小于0.5（0.1228），表明遵循Fickian扩散。在共聚焦激光扫描显微镜部分，纳米脂质体凝胶制剂显示出比对照组显著更大的皮肤渗透深度和强度。在体内皮肤刺激性研究中，皮肤刺激评分平均为0，低于阈值5，组织学评估显示GEL4处理组与对照组相比无显著异常。在体内抗癌活性部分，GEL4抑制DMBA+紫外线辐射诱导的小鼠皮肤肿瘤发生，与5-FU乳膏相比表现出更优异的疗效，肿瘤数量逐渐减少且肿瘤尺寸显著减小。在组织病理学研究中，GEL4治疗显示表皮和真皮层次完整可辨，无角蛋白聚集和有丝分裂象，与模型组相比表皮细胞增殖、深染细胞核和核质比显著降低。在脂质过氧化测定中，GEL4治疗组MDA水平显著降低，SOD和CAT活性显著恢复，GSH含量显著恢复。

讨论部分总结：本研究通过构效关系分析表明，吲哚连接的腙衍生物中亚胺部分取代基的性质关键影响细胞毒性潜力，蒽基团（5l）表现出最高效力。纳米脂质体凝胶制剂的开发基于MTT结果选择5l，纳米脂质体凝胶通过促进药物穿透角质层增强药物渗透、提供持续释放特性维持治疗浓度、保护封装药物免受降解、提供水合作用改善皮肤渗透性并最小化刺激性，具有生物相容性和非侵入性优势。体外释放研究表明GEL4的持续释放行为优于脂质体和纯药物混悬液。离体渗透研究显示纳米脂质体凝胶的渗透性显著优于5l混悬液。研究结论翻译：本研究合理设计并合成了一系列12种腙连接吲哚衍生物以评估其抗癌潜力，化合物5l表现出最有前景的活性，通过凋亡诱导细胞死亡并阻滞细胞周期于G2期。开发了负载5l的纳米脂质体凝胶用于体内生物学评价，该凝胶表现出持续和受控释放，渗透性优于5l混悬液，无皮肤刺激性，体内抗癌活性显著优于5-FU乳膏。分子对接和分子动力学模拟证实了5l与mTOR激酶受体的合理结合模式和蛋白–配体复合物稳定性。总之，这些吲哚连接的腙衍生物代表了进一步优化开发更有效抗癌治疗剂的有价值先导化合物。