市场相关少层石墨烯增强环氧复合材料磨损颗粒的多模态检测与吸入危害评估

《Small》：Detection and Inhalation Hazard Assessment of Wear Particles Arising From Abrasion of Market-relevant Graphene Reinforced Composites

　　

含有石墨烯基二维（2D）纳米片的商业产品日益被开发用于增强机械、热和电性能。然而，制造或报废处理过程中可吸入颗粒的潜在释放引发了对呼吸健康的担忧。本研究探讨了工业相关少层石墨烯（FLG）增强环氧复合材料经机械磨损产生的空气传播颗粒的肺细胞毒性和免疫调节活性。结合高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）、拉曼显微镜和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）的多模态分析策略，能够可靠检测原始复合材料和磨损复合材料中的FLG并进行空间映射。磨损主要产生FLG仍包埋于其中的复合材料碎片，未发现FLG纳米片突出或自由释放的迹象。在先进的支气管和肺泡上皮气液界面（ALI）模型中，磨损环氧颗粒和FLG–环氧颗粒均未诱导细胞毒性或促炎反应。仅在高暴露剂量的磨损环氧颗粒下观察到黏液纤毛清除率（MCC）的适度降低，且FLG增强未放大该效应。原始FLG在肺泡巨噬细胞中触发强烈的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌，而磨损FLG–环氧颗粒仅引起极小反应。总体而言，研究结果表明，在生产和使用寿命终止场景下，吸入FLG基环氧复合材料释放的碎片与有限的急性呼吸毒性相关。

该论文发表于《Small》。研究背景是：含石墨烯基二维（2D）纳米片的复合材料因可增强电/热导率、刚性、轻质性和耐久性而日益商业化；但生产、使用和报废处理中的机械磨损可能释放可吸入颗粒，其生物效应可能不同于原始材料。问题在于石墨烯在复杂聚合物基质和生物体系中的检测与空间分布分析困难，且针对石墨烯增强聚合物复合材料全生命周期释放颗粒的吸入安全性结论有限。为此，研究人员以1%（w/w）少层石墨烯（FLG，指10–12层石墨烯片）增强环氧复合材料为市场相关模型，结合多模态材料表征与肺细胞模型，评估机械磨损释放颗粒的吸入危害，并比较原始FLG、磨损环氧和磨损FLG–环氧颗粒。结论是磨损主要产生FLG仍嵌于环氧基质中的碎片，未见突出或自由FLG纳米片；原始FLG可诱导明显TNF-α分泌，而磨损FLG–环氧颗粒反应有限；上皮模型未见急性细胞毒性，高剂量磨损环氧仅中度降低MCC且FLG未加剧。意义在于将生命周期相关材料表征与机制毒理学终点连接，为危害评估和石墨烯基复合材料的安全设计提供依据，同时指出单配方研究的局限。

关键技术方法不超过250字：采用高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）、拉曼显微镜/共聚焦拉曼显微镜（CRM）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS/Orbi-SIMS）进行材料检测与空间映射；用动态光散射（DLS）表征悬浮颗粒，用Taber磨损模拟报废磨损并实时监测空气传播亚微米颗粒。生物评价使用大鼠肺泡巨噬细胞试验（AMA；NR8383细胞）、原代人支气管上皮（pHBE）MucilAir模型、ALIsens共培养模型和原代肺泡AlveolAir模型；MucilAir由五名健康供者原代支气管上皮细胞混合重建，AlveolAir来自健康供者肺组织，ALIsens使用A549、EA.hy926和THP-1细胞系。检测乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖醛酸酶（GLU）、TNF-α、白细胞介素（IL）-8、48重细胞因子/趋化因子、跨上皮电阻（TEER）、纤毛搏动频率（CBF）、MCC和流式表面标志。

结果部分：2.1 原始FLG纳米片的理化特征：通过HR-TEM、拉曼光谱和DLS显示FLG为片状结构，平均横向直径631±368 nm，10–12层，层间步高约0.32 nm；拉曼D、G、D'和2D带分别位于1309、1585、1615和2613 cm^?1，2D带半高宽45 cm^?1，ID/IG为2.4；0.1%牛血清白蛋白（BSA）稳定悬浮，流体动力学尺寸690±88 nm。2.2 模拟生命周期条件下环氧产品基质中FLG的检测与物理转化：通过CRM在环氧板中定位FLG并显示其团聚分布；拉曼可在磨损颗粒中检测FLG特征且无环氧背景干扰；ToF-SIMS未能直接无歧义检测石墨烯，但CNO^?和Cl^?信号与拉曼图空间一致，Orbi-SIMS检测到烷基苯磺酸盐、棕榈酸盐等杂质，月桂基硫酸盐仅在FLG–环氧板中检出并富集于表面；HR-TEM显示磨损颗粒中FLG嵌入环氧基质，横截面仍为10–12层、层间距约0.32 nm，未见游离或突出FLG；DLS显示磨损环氧和FLG–环氧颗粒流体动力学尺寸分别为1164±292 nm和1673±243 nm，实时测量显示空气传播亚微米颗粒电迁移直径主要约40–400 nm，内毒素水平低于限值。2.3 FLG及磨损FLG–环氧复合材料对原代支气管上皮细胞培养的细胞毒性和黏液纤毛清除功能影响：通过MucilAir重复暴露4天，ZO-1紧密连接未见明显破坏；TEER有短暂变化但仍高于100 Ω×cm²；CBF无显著影响；磨损环氧在高剂量下剂量依赖地轻度降低MCC，SEM见黏液-颗粒复合物积累但纤毛形态未扰动，FLG和FLG–环氧无显著MCC影响；LDH和IL-8无显著增加；48重因子中FLG诱导IL-1RA、IL-1α、sCD40L、IL-6和FGF-2，磨损环氧诱导IP-10、M-CSF、RANTES、G-CSF、MCP-1和MDC，FLG–环氧无显著变化。2.4 肺泡肺细胞培养对磨损FLG和环氧复合材料的细胞毒性和免疫调节反应：通过CRM/SEM显示肺泡巨噬细胞摄取FLG或FLG–环氧后胞内可检出FLG，磨损环氧仅检出环氧；原始FLG无细胞毒性但强烈诱导TNF-α，且多粘菌素B不能抑制，提示为颗粒效应；磨损环氧和FLG–环氧呈相似剂量依赖细胞毒性，过滤≤5 μm后LDH/GLU释放增加且FLG–环氧略高，原文认为主要由环氧基质驱动，FLG可能通过改变磨损颗粒形状/尺寸产生间接影响；FLG–环氧未过比例增加TNF-α，提示FLG多被环氧包埋覆盖。ALIsens模型中各材料24 h未见细胞毒性，磨损环氧剂量依赖增加THP-1细胞TSLPr表达而FLG和FLG–环氧无变化；FLG–环氧诱导MCP-1、IL-6和GRO-alpha，环氧诱导MCP-1和GRO-alpha，所有材料下调IFN-γ。AlveolAir原代肺泡模型中，FLG和磨损环氧未显著降低TEER，FLG–环氧在第3–4天高剂量下显著降低TEER但仍高于100 Ω×cm²；LDH无增加；第4天FLG（5 μg cm²）和FLG–环氧（10 μg cm²）显著增加IL-8，磨损环氧无显著影响；48重因子未见主要变化，FLG–环氧暴露后部分炎症因子显著降低，FLG暴露后部分因子轻度增加但无统计显著，总体提示短期重复高剂量下有限炎症反应。

讨论部分总结：原文强调碳基纳米材料复合材料全生命周期安全性研究不足，需将原始与释放材料表征和综合危害评估结合；本研究用拉曼、HR-TEM和ToF-SIMS实现FLG在环氧基质及磨损颗粒中的检测与定位，发现磨损主要生成FLG嵌入型碎片，无游离FLG释放证据，但基质中FLG大团聚体提示部分碎片局部FLG浓度可能较高。原始FLG可诱导明显TNF-α分泌，而环氧基质包埋后炎症反应有限；上皮模型中未见急性细胞毒性，仅高剂量磨损环氧中度降低MCC且FLG未放大该效应。原文还指出FLG氧化状态未表征，其贡献不能确定；ALIsens中磨损环氧增加TSLPr而FLG–环氧无变化，原文提出石墨烯可能通过范德华和π–π堆积吸附小有机分子、隔离残留胺类致敏物，但尚需实验确认。总体认为在生产与报废场景下吸入磨损环氧及FLG–环氧颗粒的健康风险有限，支持安全设计，但研究仅评估一种环氧树脂、固化剂和FLG配方，商业产品差异大，需多配方研究验证。

研究结论翻译：针对碳基纳米材料复合材料全生命周期的安全性研究有限，且缺乏将原始材料和释放材料的全面表征与综合危害评估相结合的研究，这已被认为是一个重要知识空白。本研究通过提供面向生命周期的环氧基石墨烯复合材料综合评估，结合深入材料表征与释放颗粒的广泛吸入危害评价，弥补了该空白。结果表明，在模拟现实生产和报废场景条件下，能够成功检测和定位环氧复合材料中的少层石墨烯。应用多种互补分析技术，包括拉曼光谱、HR-TEM和ToF-SIMS，评估石墨烯纳米片在产品基质和磨损复合材料颗粒中的空间分布。HR-TEM成像显示，磨损主要产生复合材料碎片，FLG仍嵌入环氧基质中。未观察到石墨烯突出或自由石墨烯纳米片释放的证据。然而，环氧基质中存在大的FLG团聚体提示某些磨损FLG–环氧碎片可能含有相对较高的局部FLG浓度。此类富集碎片可能在职业处理或报废环境释放期间导致FLG暴露增加。生物学评估显示，原始少层石墨烯与其环氧基复合材料反应不同。原始FLG（在0.1% BSA-水中制备）未损害肺泡巨噬细胞活力，但诱导明显的TNF-α分泌，表明促炎活性。相反，从磨损FLG–环氧复合材料收集的颗粒仅诱导有限的TNF-α反应，提示掺入聚合物基质减轻了FLG的炎症潜力。潜在FLG氧化对该反应的贡献仍不清楚，需进一步研究。在支气管和肺泡上皮细胞培养模型中，暴露于FLG、磨损环氧或磨损FLG–环氧复合材料颗粒均未影响细胞活力。仅在相对高暴露剂量高于10 μg cm²时观察到亚毒性效应，其中磨损环氧复合材料适度降低黏液纤毛清除率。复合材料中FLG的存在未增加这些效应。总体而言，数据表明，在生产和使用寿命终止场景下，即使在高暴露水平下，吸入磨损环氧和FLG–环氧复合材料颗粒相关的健康风险有限。通过将生命周期相关材料表征与机制毒理学终点联系起来，本研究为危害评估提供了重要见解，并支持工业石墨烯基复合材料的安全设计开发。最后，研究人员希望强调，本研究评估了一种特定的环氧树脂、固化剂和FLG配方。由于商业产品在组成、填料特性、制造工艺和老化条件方面各不相同，这些发现可能不能完全反映市场上可获得的含FLG产品的广泛谱系。建议使用多种配方进行进一步研究，以评估所提出方法和发现的更广泛适用性。