近红外比率型纳米传感器用于环境动态变化下植物过氧化氢成像

《Advanced Materials》：Near-Infrared Imaging of H2O2 in Plants With Nanosensors Under Environmentally Changing Conditions

　　

光学传感器是监测生物系统的有力工具，然而其实际部署常受自发荧光、机械运动和光照波动等环境干扰的限制。这些挑战在植物中尤为突出，因为植物需要并利用光，这阻碍了（荧光）传感器用于检测植物胁迫信号（如H2O2）。本研究提出了一种比率型传感平台，通过整合三种光谱不同的组分克服了上述限制：1）基于适配体修饰的近红外（NIR）荧光单壁碳纳米管（SWCNTs，~1000 nm）的H2O2传感器；2）基于聚乙二醇修饰的埃及蓝纳米片（EB–NS，900–955 nm）的稳定NIR参比信号；3）用于校正植物NIR自发荧光尾部（>835 nm）的可见光（VIS）信号（~641 nm）。这种比率型方法能够在相关扰动（包括叶片旋转和风致运动）下实现稳健的信号校正。此外，该方法允许在动态变化的照明条件（>300%）下连续监测H2O2，与单通道检测相比，信号对比度提升了75%。通过光谱分辨纳米传感器信号和内源性植物自发荧光，该策略能够在现实环境条件下实现对胁迫诱导H2O2的体内监测。这项工作建立了抗干扰的光学传感技术，推动了面向精准农业的可现场部署纳米传感器技术的发展。

研究背景与现存问题

过去三十年间，生物与非生物胁迫给全球农业造成了超过三万亿美元的经济损失。基于精准农业的策略有望保障作物生产力免受气候变化等环境挑战的影响。纳米传感器作为一种物种非依赖、非破坏性的工具，能够实时读取植物信号，且无需基因工程改造。然而，田间复杂恶劣的条件对传感器的商业化应用构成了巨大挑战。例如，复杂的植物生长环境和植物自发荧光会产生显著的背景噪声和信号不稳定性。叶绿素和木质素等荧光分子在从可见光到远红外的宽谱范围内均有发射，某些红光/远红光受体甚至能在近红外区发光。未来可田间部署乃至实验室规模的植物信号监测/表型技术，将不可避免地面临光照条件波动和植物机械运动的干扰。光照暴露在从季节变化到亚秒级波动的时间尺度上变化，而风或其他机械扰动则会引起叶片颤动或整株植物移动。因此，光学（纳米）传感器的应用通常需要高质量激发光源、精心设计的光路、固定的植物叶片以及暗室成像环境。

为解决这些问题，研究人员开发了一种基于近红外比率型传感平台的多元检测策略。

主要关键技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）利用水相两相提取法分离出单一手性（6,5）-单壁碳纳米管（SWCNTs），并通过有机溶剂辅助的表面交换将其功能化为血红素适配体DNA，构建H₂O₂传感单元；2）通过行星式球磨结合液相离心法制备不同尺寸和表面修饰的埃及蓝纳米片（EB–NS），作为稳定的NIR参比探针；3）搭建了一套多通道离轴成像系统，利用二向色镜和滤光片将叶片发射光分解为三个通道：传感通道（Channel_CNT955，>955 nm）、参比通道（Channel_EB900，900–955 nm）和可见光自发荧光通道（Channel_AF641，641 nm）。

研究结果

2.1 用于体内多元H₂O₂检测的NIR比率型纳米传感器

研究人员首先优化了传感材料（HeAptDNA-(6,5)-SWCNTs）与参比材料（EB–NS）的比例，发现0.2 nM SWCNTs与0.025 mg/mL EB–NS的组合最佳。加入0.1 μM血红素后，传感器在保持适度起始荧光损失的同时，对100 μM H₂O₂表现出强响应。机理研究表明，血红素催化的芬顿样反应产生的羟基自由基淬灭了SWCNT荧光，且该过程是可逆的。该比率型传感器对葡萄糖、赤霉素和脱落酸等植物代谢物和激素的交叉响应低于10%，展现出良好的选择性。在菠菜表皮细胞的亚细胞水平实验中，200 μM H₂O₂引起了预期的传感器荧光随时间淬灭。为期14天的栽培实验表明，传感器处理后的植物未表现出可观察到的植物毒性，验证了其良好的体内生物相容性和安全性。

2.2 植物叶片中的多元NIR荧光检测

研究人员设计了多通道成像平台，将叶片发射光分解为三个通道。二维激发-发射光谱显示，经ATPE纯化的（6,5）-SWCNTs避免了与EB–NS参比通道（900–955 nm）的光谱串扰。植物NIR自发荧光随波长增加而降低，但在NIR区域仍有拖尾。研究人员利用可见光通道（Channel_AF641）作为与植物NIR自发荧光相关的互补读数。通过梯度离心获得直径小于200 nm并经PEG-PL修饰的EB–NS（pEB–NS₂₀₀），其在叶片内的扩散面积与SWCNTs高度重叠（95%），确保了两种材料的共定位。健康菠菜叶在561 nm激发下显示出宽谱NIR荧光，而脱色叶则无发射。在叶片中，注入比率型传感器的区域呈现出两种荧光材料的双峰发射特征。

2.3 针对机械扰动的稳健多元传感

研究人员使用步进电机精确控制叶片旋转角度，模拟机械扰动。当旋转角度从0°增加到60°时，SWCNT和pEB–NS₂₀₀的荧光强度分别下降至初始值的68%和62%，但归一化的传感器响应在0°到40°间波动低于1%。在风扇模拟的风致扰动实验中，40秒内单通道测量出现了高达38%-40%的剧烈同步波动，而多元荧光成像则将噪声抑制在5%以下。这表明比率型方法显著提高了对机械扰动的鲁棒性。

2.4 动态光照下胁迫诱导H₂O₂的实时多元检测

研究人员建立了动态高光胁迫实验。在激光功率从20 mW增至120 mW时，单个通道强度增加了超过600%，而比率型荧光变化低于3%。在高光胁迫下，单个通道均出现大幅荧光波动，其中可见光自发荧光通道增幅超过770%。相比之下，由Channel_CNT955和Channel_EB900像素级计算得到的比率图清晰地揭示了H₂O₂诱导的荧光淬灭及部分恢复。通过利用可见光自发荧光信息校正两个NIR通道中的自发荧光成分，校准后的多元荧光响应在高光胁迫下显示出14%的荧光淬灭，信号对比度相对于直接比率分析提升了75%。该策略在单子叶植物玉米叶片中也得到了验证，证明了其跨物种适用性。

总结与讨论

总之，研究人员开发了一种NIR比率型传感器，用于在动态条件下对活体植物中胁迫诱导的H₂O₂信号进行多元检测。基于强度的光学传感器易受激发波动和机械扰动的影响，而在植物这类光敏生物中使用光作为读数本身就是一个挑战。在该研究中，SWCNTs作为灵敏的识别单元，EB–NS提供稳定的参比信号，自发荧光则作为包含光合生理信息的无标记信号，用于校正比率型传感器信号，使多元响应增强了75%。实验证明，这种基于光谱窗口解卷积的多元光学检测策略提供了稳健的实时传感器信号读出。该方法克服了植物等光敏生物具有与动物无关的光相关背景信号的难题，且这些信号在田间无法避免。具体而言，该方法在面对机械扰动和光强变化时仍能维持可靠信号。这对于NIR方法尤为重要，因为研究表明植物在可见光区的强固有自发荧光会延伸至NIR区域并影响光学成像。研究人员预计，这种多元原位传感方法将为精准农业提供有价值的工具，实现在复杂多变环境中对植物化学信号的连续田间监测，或用于植物表型分析。比率型纳米传感器的多元成像因此在复杂条件下展现出稳健的性能。此外，该方法可扩展到针对其他胁迫相关信号的不同传感器和材料。