SpaCut：转录本感知形态融合驱动的亚细胞空间转录组学稳健细胞分割框架

《Advanced Science》：SpaCut: Transcript-Aware Morphology Fusion for Robust Cell Segmentation in Subcellular Spatial Transcriptomics

亚细胞空间转录组学（SST, Subcellular Spatial Transcriptomics）为在亚细胞分辨率下解析组织结构提供了前所未有的机会。因此，准确的细胞分割是分析SST数据的基本前提，因为精确的转录本分配对于下游单细胞解读至关重要。现有方法常常忽视转录本的空间组织、依赖简化的几何先验，或难以协调转录本衍生特征与形态衍生的空间引导。这一局限限制了其对不规则细胞形状的适应性，常导致转录本误分配。为解决该问题，研究人员提出SpaCut，一个统一的深度学习框架，旨在有效整合转录组特征学习与动态形态学引导。SpaCut包含基因逐通道注意力（GWA, Gene-Wise Attention）模块和核引导注意力融合（NGAF, Nuclei-Guided Attentive Fusion）模块。GWA编码高维转录本图并跨多个深度聚合特征。NGAF利用编码后的转录本特征调制基于距离的核软掩码，并通过渐进训练细化以核为锚定的细胞边界。在来自不同平台（包括Xenium、CosMx、MERSCOPE和Stereo-seq）的七个数据集上的广泛评估表明，SpaCut在分割准确性以及与单细胞参考数据的一致性方面显著优于最先进方法。源代码见https://github.com/wenwenmin/SpaCut。

研究背景：亚细胞空间转录组学（SST, Subcellular Spatial Transcriptomics）能够在完整组织中于亚细胞分辨率测量基因表达，是解析细胞如何组织成组织并与其环境互作的基础。准确的细胞分割是分析SST数据的前提，因为转录本精确归属决定下游单细胞解读。分割过度会纳入细胞外噪声或邻近细胞信号，扭曲空间基因表达模式；分割不足会丢失有效转录本，导致基因表达谱不完整。现有方法大致包括图像法、转录本法和图像–转录本整合方法。图像法主要依赖染色强度、纹理和核形态，难以捕获核外复杂基因表达；转录本法则主要从分子分布推断边界，常与成像数据不一致；整合方法虽试图结合二者，但编码稀疏转录本分布并自适应整合核来源空间先验仍具挑战。不同SST平台在分辨率和基因谱能力上差异显著，发展适配多样数据特征与分辨率的统一细胞分割方法仍是重要挑战。为此，研究人员提出SpaCut，一个转录本感知、核引导的统一深度学习框架，并在来自四个平台、七个数据集上开展评估。该论文发表于《Advanced Science》。

关键技术方法：SpaCut的GWA将原始基因通道投影至学习特征空间，经深度可分离卷积（DSC）、通道重校准和多深度特征聚合生成转录本编码特征；离散核分割经符号距离变换（SDT）和温度缩放sigmoid形成连续核软掩码；NGAF以FiLM式投影头由基因特征生成空间系数图，动态调制核软掩码，融合原始与调制软掩码并空间注意力细化；渐进训练先以加权交叉熵训练前景定位，再冻结编码特征训练NGAF细化单细胞边界。样本为七个公开SST数据集：Xenium四数据集（乳腺癌、肺癌、小鼠结肠、人胰腺）、CosMx SMI人胰腺、MERSCOPE卵巢癌和Stereo-seq小鼠脑。评价用AJI和实例F1。

2.1 SpaCut概述：通过构建GWA与NGAF及渐进训练流程，研究人员表明SpaCut先由GWA编码基因表达并重加权基因重要性，分类头生成粗前景定位，离散核分割经符号距离映射平滑为软掩码，NGAF以核软掩码为空间先验并由基因特征生成空间系数图动态调制该先验，从核向精确细胞边界扩展；渐进训练先优化前景定位，再冻结编码特征优化实例边界，联合前景一致性与单细胞精度产生稳健分割。

2.2 SpaCut在多样空间转录组平台和组织架构中实现准确细胞分割：通过在Xenium、CosMx SMI、MERSCOPE和Stereo-seq的七个数据集（覆盖上皮、基质和神经组织）上与UCS、Baysor、SCS等比较，SpaCut在多种组织中得到与参考边界更接近、更平滑且生物学连贯的分割，避免UCS的过分割，在稀疏转录本和高分辨率Stereo-seq小鼠脑数据中保持紧凑形态，在Vizgen卵巢癌中以默认低估分割作核输入仍提高转录本覆盖，在CosMx人胰腺中仅用核荧光和转录本信息即与全细胞参考高度一致；在Xenium乳腺癌中随机子采样转录本至80%、60%、40%、20%并以原始数据为真值，SpaCut在20%信号下仍稳健且与苏木精-伊红（H&E, hematoxylin and eosin）染色一致，F1优于BIDCell和UCS；在Xenium肺癌转录本损坏实验中，SpaCut在三方法中取得最高实例F1和AJI。结论是SpaCut具有跨模态泛化能力和对噪声、不完整数据的稳健性。

2.3 SpaCut在Xenium数据集上达到最先进分割精度：研究在Xenium人肺癌、人胰腺（FFPE）和小鼠结肠（FF）三个数据集上，以Xenium 2.0双通道荧光同时标记核和细胞边界作为可靠真值，采用聚合杰卡德指数（AJI, Aggregated Jaccard Index）和交并比（IoU, Intersection over Union）阈值0.4下的F1分数与多种代表方法比较；SpaCut在三数据集分别取得AJI 0.7461、0.7454、0.6151和F1 0.9381、0.8953、0.8980，并在广泛IoU阈值范围内保持更高F1。结论是联合形态特征与转录组空间信号可提高边界描绘和实例检测。

2.4 SpaCut在Xenium乳腺癌上实现多尺度形态与转录组一致性：通过与H&E染色比对及细胞水平、基因水平统计，研究人员发现SpaCut在核染色清晰区域准确分割、低对比或背景区域正确忽略，细胞数、总转录本、每细胞基因/转录本和稀疏度呈平衡分布，更多基因的细胞表达比例高于基于核的表达，提示细胞质转录本恢复改善；在三个Xenium数据集中，SpaCut在非参考方法中取得最高正确细胞质恢复（0.6964–0.7324）和最高分配F1（0.7619–0.8371），核伸长与细胞掩码伸长相关显示强核–细胞形状一致，且每细胞转录本数与竞争方法相当；打乱或移除转录本使实例F1下降，完整模型优于固定膨胀和解析软掩码对照。结论是SpaCut在保持细胞形态的同时改善转录本捕获，其边界反映细胞结构和基因表达，而非单纯几何扩张。

2.5 SpaCut利用scRNA-seq数据改善空间细胞类型注释：通过scvi-tools将SpaCut分割细胞与组织匹配的单细胞RNA测序（scRNA-seq, single-cell RNA sequencing）参考整合，联合统一流形近似与投影（UMAP, Uniform Manifold Approximation and Projection）显示更好的跨模态对齐，SpaCut能精确区分Invasive Tumor与DCIS亚型并与手动注释一致；以皮尔逊相关系数（PCC, Pearson correlation coefficient）计算分割所得各细胞类型平均表达与scRNA-seq对应簇的相关性，SpaCut高于基线，细胞类型比例一致性也得到总结；定性上，SpaCut产生与scRNA-seq高度一致的表达谱，使KRT7和TACSTD2等肿瘤标志基因空间模式更清晰，并排除细胞外基质细胞污染，转录本计数与过大的Cell 10X分割相当；邻域富集分析捕获Proliferative Invasive Tumor与Invasive Tumor共定位、Myoepithelial ACTA2与Stromal邻近以及CD4和CD8 T细胞靠近IRF7和LAMP3树突状细胞，跨切片无需微调仍稳定，注释指标变化至多0.0038，差分表达效应量一致性最高（mean logFC PCC，其中logFC为对数倍数变化），邻域富集结构最接近参考（PCC；RMSE为均方根误差）且配体–受体签名与参考高度一致。结论是SpaCut保留生物学相关空间背景，有助于发现细胞间关系。

2.6 核分割质量对SpaCut性能的影响：通过在以Xenium人肺癌数据集（含官方核和细胞分割注释）上，将Nuclei 10、Cellpose-SAM、Cellpose、Cellpose3、DeepCell、StarDist、SAM和Watershed等图像法所得核分割作为SpaCut初始化输入，并进行锚点移除、合并、拆分实验，研究人员发现高质量核输入使SpaCut边界与Cell 10参考接近，低质量核分割损害边界推断；以Nuclei 10为基准时Cellpose-SAM和Cellpose一致性F1为0.54和0.61，SAM和Watershed为0.35和0.18；以官方Cell 10为真值时Nuclei 10初始化F1最高为0.85；移除、合并或拆分10%–30%锚点使实例F1单调下降，缺失锚点影响最大（30%时从0.8470降至0.4775）。结论是上游核掩码质量直接约束细胞恢复；SpaCut细化每个给定核锚对应的细胞候选，目前不做多锚合并或无锚恢复。

2.7 消融研究与计算性能：通过在三个Xenium数据集上做组件消融，研究人员发现NGAF中移除空间注意力或原始与调制核软掩码的拼接会降低性能，GWA中移除深度可分离卷积与通道重校准块（DSC_CA）也降低AJI和F1；仅用最深特征图替代多深度特征融合造成最大单组件下降，在Xenium人肺癌中AJI和F1从0.7465和0.9395降至0.6805和0.8871；同时移除空间注意力和DSC_CA进一步降低性能，尤其在小鼠结肠；完整模型在三数据集均取得最佳AJI和F1。计算性能方面，SpaCut在Xenium、Stereo-seq和CosMx基准中保持运行时间与分割细胞数之间的有利平衡。结论是转录本特征编码、多深度聚合和核引导融合具有互补作用。

讨论总结：SpaCut将GWA与NGAF整合，前者编码高维基因表达以捕获空间背景并抑制噪声，后者依据实际转录组信号动态调制核先验以引导细胞边界扩展，渐进训练协同全局前景定位与实例级边界细化。七数据集四平台评估显示其分割准确性（F1）和实例质量（AJI）优于最先进基线；与仅依赖核的图像法不同，SpaCut利用基因表达识别细胞质区域，恢复核外有效转录本；子采样实验显示仅20%转录本仍保持准确细胞结构，说明可处理稀疏信号和技术噪声。消融显示GWA与NGAF互补，核分割质量与初始核锚准确性显著相关：高质量核输入可释放边界细化潜力，次优输入导致性能下降，可靠核检测是转录本驱动扩展的前提。未来工作将减少对核锚的依赖，引入显式多锚合并和无锚候选恢复以处理多核细胞或核信号弱/缺失组织，并探索置信感知核引导和自适应后处理。

研究结论（译）：总之，SpaCut为分析亚细胞空间转录组学数据提供了一种有效且统一的解决方案，在分割性能上优于当前最先进方法。通过整合转录组和形态学信息，在异质平台上实现稳健的边界推断，SpaCut有助于更准确地对组织异质性和细胞相互作用进行下游分析。