镧系/过渡金属离子配位纳米结构调控“激活-抗性消除”以强化铜死亡与肿瘤免疫治疗

《Advanced Materials》：“Activation-Resistance Elimination” Regulation by Lanthanide/Transition Metal Ion-Coordinated Nanostructures Intensifies Cuproptosis and Tumor Immunotherapy

　　

铜死亡（cuproptosis）的治疗效果受限于其激活不足及耐药机制。在此，一种具有优化配位结构的镧系/过渡金属离子配位纳米颗粒La-Cu@Lap/IWR-1，已被证明在实现全面抗性消除型铜死亡激活方面取得了显著成效。La3+不仅通过配位作用增强Cu2+介导的多重类酶活性以放大氧化应激，还通过破坏溶酶体酸化功能来提高铜离子的可利用性。此外，联合拉帕替尼（Lap）可减轻细胞运动性介质1（MEMO1）对Cu2+的屏蔽效应，显著增强铜死亡激活效能。与此同时，所释放的Wnt抑制剂IWR-1不仅能抑制铜死亡诱导过程中伴随激活的Wnt/β-catenin信号通路，以削弱肿瘤细胞的氧化应激耐受性，还能与Lap协同下调缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达，从而有效消除铜死亡耐药性。这种综合性铜死亡不仅触发显著的免疫原性细胞死亡，还同步抑制肿瘤转移的关键步骤，如上皮-间质转化和细胞外基质重塑。本研究提出了一种利用镧系/过渡金属离子配位纳米材料实现全面抗性消除型铜死亡激活的治疗策略，为肿瘤治疗提供了新的切入点。

论文解读：镧系/过渡金属离子配位纳米结构调控“激活-抗性消除”以强化铜死亡与肿瘤免疫治疗

一、研究背景与科学问题

铜死亡（cuproptosis）是一种铜依赖性细胞死亡模式，其核心机制在于铁氧还蛋白1（FDX1）介导过量游离铜还原为Cu⁺，进而靶向并寡聚化线粒体三羧酸循环中的脂酰化蛋白二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT），导致铁硫簇蛋白丢失并触发不可逆的蛋白质毒性应激。由于该机制具有高度选择性杀伤代谢活跃肿瘤细胞的特点，靶向诱导铜死亡已成为癌症治疗领域的研究热点。然而，现有研究策略主要聚焦于通过外源铜离子载体或铜基纳米材料实现肿瘤细胞内铜离子富集，仅强调“铜离子导入—铜死亡激活”的单一通路，忽视了肿瘤细胞在长期适应中演化出的多维铜死亡耐药网络。该网络涵盖铜离子代谢螯合（由细胞运动性介质1（MEMO1）介导的游离铜捕获）、氧化应激耐受增强（由Wnt/β-catenin通路驱动的抗氧化基因转录）以及肿瘤微环境适应性调节（由缺氧诱导的缺氧诱导因子1α（HIF-1α）激活），直接削弱铜离子的致死效应。此外，已有研究尝试将铜死亡与其他程序性细胞死亡通路（如铁死亡、焦亡）联合以增强疗效，但此类策略主要依赖不同死亡通路的并发激活，未能解决铜死亡耐药的核心调控机制，既无法协同阻断多个耐药节点（如MEMO1、Wnt/β-catenin、HIF-1α），也未阐明各耐药通路之间的交叉调控网络。这种“重激活、轻逆转”的研究现状使肿瘤细胞能够在治疗后期通过耐药网络重建生存优势，最终导致病灶复发和转移。因此，设计一种整合铜死亡激活与多维耐药逆转的协同策略，是推动铜死亡疗法从机制概念迈向临床可行治疗模式的关键瓶颈。

二、研究内容与总体结论

针对上述挑战，研究人员提出了一种以“激活-抗性消除”为核心的铜死亡调控策略，通过调控La³⁺/Cu²⁺与拉帕替尼（Lap）及Wnt抑制剂IWR-1的配位比例，利用La³⁺和Cu²⁺对O和N原子的差异化配位能力，成功合成了镧系/过渡金属离子配位纳米颗粒La-Cu@Lap/IWR-1。该纳米颗粒通过多重机制实现全面肿瘤铜死亡：一方面，La³⁺的引入增强了Cu²⁺介导的类酶活性（包括超氧化物歧化酶（SOD）样、过氧化物酶（POD）样和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）样活性），显著提升细胞内氧化应激水平；同时，可降解的La-Cu@Lap/IWR-1释放La³⁺破坏溶酶体酸化功能，增加溶酶体内铜离子的可利用性；释放的Lap则减轻MEMO1对Cu²⁺诱导的氧化还原活性及活性氧（ROS）生成的屏蔽效应，进一步放大氧化应激。另一方面，释放的IWR-1抑制铜死亡激活过程中伴随的Wnt/β-catenin信号通路，削弱肿瘤细胞对氧化应激的耐受性；Lap与IWR-1协同下调HIF-1α表达，阻断HIF-1α通过转录激活金属硫蛋白2A（MT2A）及干扰DLAT功能而增强铜死亡耐药的效应。最终，该体系通过铜死亡激活与耐药衰减的协同作用，成功实现全面肿瘤铜死亡，促进损伤相关分子模式（DAMPs）的大量释放，显著激活系统性抗肿瘤免疫，并同步抑制肿瘤迁移与侵袭。该研究首次在镧系/过渡金属离子配位纳米颗粒中实现“激活-抗性消除”策略的铜死亡协同调控，相关成果发表于《Advanced Materials》。

三、关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法：基于La³⁺/Cu²⁺对O和N原子差异化配位能力的配位反应合成方法；扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）及紫外-可见分光光度法（UV-vis）等材料表征技术；理论模型计算用于分析配位结构与键长；动态光散射（DLS）用于监测材料稳定性；细胞实验采用4T1小鼠乳腺癌细胞系及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和L929细胞；动物实验采用BALB/c小鼠建立单侧4T1肿瘤模型、近端-远端双侧肿瘤模型及肺转移模型；转录组测序（RNA-seq）用于分析差异表达基因及信号通路富集。

四、研究结果

材料制备与表征。 研究人员通过调控反应条件成功合成了球形La@Lap/IWR-1纳米颗粒，平均粒径约89.34 ± 12.66 nm，呈无定形晶体结构。定量分析表明La³⁺与Lap、IWR-1的配位比为1:2:2。进一步与Cu²⁺混合搅拌获得La-Cu@Lap/IWR-1，粒径约72.78 ± 11.66 nm，La与Cu摩尔比约为1:2。XPS和FT-IR分析证实了La─O和Cu─N配位结构的存在。理论模型计算表明，La─O配位比La─N更稳定，Cu─N配位比Cu─O更稳定；La³⁺与Lap的磺酰氧和IWR-1的羰基氧形成八面体配位结构，Cu²⁺与Lap的嘧啶环氮和IWR-1的吡啶环/酰胺氮形成四面体配位结构。Lap和IWR-1的包封率分别为90.40% ± 3.20%和76.30% ± 5.70%。DLS监测显示材料在30天内保持良好稳定性。

多重类酶活性与可降解性。 通过硝基蓝四唑（NBT）、3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）实验证实，La-Cu@Lap/IWR-1具有SOD样、POD样和GSH-Px样活性，且均显著优于仅含Cu²⁺的Cu@Lap/IWR-1。稳态酶动力学分析表明，La-Cu@Lap/IWR-1对H₂O₂的米氏常数（K_m）为10.60 mM，低于Cu@Lap/IWR-1的15.20 mM，最大反应速率（V_max）为34.10 × 10^?8 M·s^?1，显著高于对照组；GSH-Px样活性的V_max为45.38 × 10^?8 M·s^?1，为Cu@Lap/IWR-1的1.52倍。添加游离La³⁺不影响Cu@Lap/IWR-1的催化活性，证实增强效应源于La─O配位键对Cu─N配位中心电子结构的调控。材料在模拟肿瘤微环境（GSH、H₂O₂、弱酸性）中表现出可降解性，而在pH 7.4条件下保持稳定，铜离子和药物释放低于2%。

增强Cu²⁺介导的氧化应激效应。 细胞摄取实验表明，La-Cu@Lap/IWR-1凭借粗糙表面具有更高的细胞摄取效率。溶酶体共定位实验显示材料被内吞进入溶酶体并造成损伤；吖啶橙染色和pH敏感荧光探针证实La³⁺释放破坏溶酶体酸化功能。蛋白质印迹（WB）分析显示La-Cu@Lap/IWR-1显著下调溶酶体膜铜转运蛋白（ATP7A、CTR1、CTR2）表达，表明溶酶体膜透化（LMP）发生，增加细胞内铜离子生物利用度。罗丹明B肼（RBH）探针检测证实La-Cu@Lap/IWR-1处理组细胞内Cu²⁺含量最高。此外，Lap通过抑制ErbB2信号通路下调MEMO1表达，减轻其对Cu²⁺氧化还原活性的屏蔽。GSH含量检测、二氢乙锭（DHE）和2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针实验证实材料高效产生ROS，3-CCA探针证实·OH生成能力最强。

转录组学分析揭示耐药通路调控。 对4T1细胞进行RNA测序分析显示，La-Cu@Lap/IWR-1处理组共有3241个转录本差异表达（1201个上调，2040个下调），远多于CuCl₂处理组的1251个。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，La-Cu@Lap/IWR-1处理组主要富集于“Wnt信号通路”和“HIF-1信号通路”，且呈显著下调趋势；而CuCl₂处理组中这两条通路呈上调趋势。基因集富集分析（GSEA）进一步证实Wnt通路关键基因（CTNNB1、MYC、CCND1）和HIF-1通路相关基因（PDK1、PDK3）显著下调。

全面肿瘤铜死亡的诱导。 免疫荧光和WB分析表明，Cu²⁺单独处理上调β-catenin和WNT3A表达，而IWR-1和La-Cu@Lap/IWR-1处理有效抑制其表达。缺氧条件下，La-Cu@Lap/IWR-1对β-catenin和WNT3A的抑制更为显著。WB分析显示La-Cu@Lap/IWR-1显著抑制HIF-1α及其下游MT2A和PDK1表达，同时DLAT表达趋势相反。铜死亡标志物检测显示，La-Cu@Lap/IWR-1处理组FDX1和硫辛酸合成酶（LIAS）表达显著抑制，DLAT异常寡聚化明显。线粒体膜电位检测、γ-H2AX免疫荧光染色和活/死染色证实材料造成严重的线粒体损伤、核损伤和最强的肿瘤细胞杀伤效应。MTT实验显示材料对4T1细胞呈浓度依赖性毒性，而对正常细胞无明显毒性。逆转实验证实四硫代钼酸盐（TTM）显著挽救细胞活力，而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）和泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK几乎无挽救效果，证实铜死亡是主要死亡途径。

免疫应答激活与抗转移能力。 钙网蛋白（CRT）暴露、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）转位及ATP释放检测证实La-Cu@Lap/IWR-1诱导免疫原性细胞死亡。树突状细胞（DCs）成熟比例从1.14%提升至5.01%。WB分析显示材料显著下调基质金属蛋白酶2（MMP2）和波形蛋白（Vimentin）表达，上调E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达，抑制成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达。划痕愈合实验和Transwell实验证实材料显著抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力。

体内抗肿瘤疗效。 在BALB/c小鼠单侧4T1肿瘤模型中，La-Cu@Lap/IWR-1经尾静脉注射有效富集于肿瘤部位，肿瘤抑制率达90.40%。苏木精-伊红（H&E）染色和KI67染色显示肿瘤组织损伤最严重，增殖功能显著抑制。免疫组化分析证实LIAS、β-catenin和HIF-1α蛋白表达显著降低。长期安全性监测显示材料可经肾脏代谢清除，无长期蓄积。

体内免疫激活与抗转移效应。 免疫学研究显示，La-Cu@Lap/IWR-1处理后成熟DCs比例达对照组4.30倍，促炎细胞因子（IL-6、IL-12、TNF-α）水平显著升高，脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞数量分别为对照组的8.00倍和3.00倍，效应记忆T细胞比例从1.65%提升至17.60%，中央记忆T细胞从3.22%提升至17.00%。在近端-远端双侧肿瘤模型中，La-Cu@Lap/IWR-1显著抑制远端肿瘤生长，证实系统性抗肿瘤免疫激活。免疫组化和免疫荧光染色显示E-cadherin表达上调、MMP2表达下调、I型胶原（COL I）沉积减少。肺转移模型实验中，La-Cu@Lap/IWR-1处理组肺转移面积最小。生存分析显示该组小鼠在整个观察期内存活率为100%。

五、结论与展望

该研究基于La³⁺/Cu²⁺对O和N原子的差异化配位能力，设计了镧系/过渡金属离子配位纳米颗粒La-Cu@Lap/IWR-1，通过铜死亡激活与抗性消除的协同调控实现全面肿瘤铜死亡。一方面，La³⁺增强Cu²⁺介导的类酶活性并破坏溶酶体酸化，Lap消除MEMO1对Cu²⁺诱导ROS的屏蔽效应，共同增强铜死亡激活效果。另一方面，IWR-1抑制Wnt/β-catenin通路并协同Lap下调HIF-1α表达，有效消除铜死亡耐药性。该策略诱导的全面铜死亡可激活强效免疫应答并抑制肿瘤转移。这一“激活-抗性消除”策略具有与免疫检查点阻断联合以转化“冷”肿瘤为“热”肿瘤的潜力，并可扩展至其他铜死亡敏感型恶性肿瘤（如三阴性乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌），其可调配位平台亦可通过金属替换或药物负载实现个性化治疗的未来优化。