陈年大蒜来源新型生物活性成分Efoba靶向CTSC抑制NET驱动神经炎症并改善脑出血后继发性脑损伤

《Advanced Science》：A Novel Bioactive Component, Efoba, From Aged Garlic Targets CTSC to Suppress NET-Driven Neuroinflammation and Ameliorate Secondary Brain Injury After Intracerebral Hemorrhage

脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是一种高死亡率和致残率的严重神经系统疾病，神经炎症驱动的继发性脑损伤是其关键病理特征。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）作为重要致病介质，可放大神经炎症、破坏血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）完整性并加重ICH后脑损伤。该研究识别了陈年大蒜来源的新型生物活性单体Efoba，并建立了可规模化全合成路线，实现百克级高纯度生产，克服了天然产物研究中收率低和供给受限的瓶颈。体内和体外实验显示，Efoba显著改善ICH诱导的神经功能损害并抑制NET形成。整合分析（有限蛋白酶解-质谱（limited proteolysis-mass spectrometry, Lip-MS）、虚拟筛选、蛋白质组学和转录组学）确定组织蛋白酶C（cathepsin C, CTSC）为Efoba的直接结合靶点。Efoba稳定小胶质细胞溶酶体膜，抑制CTSC释放，阻断NET生成，并对NETs驱动的神经炎症发挥神经保护作用。CTSC敲除和CTSC过表达实验进一步证实CTSC在介导Efoba神经保护和抗炎活性中的不可或缺作用。综上，该研究首次证明Efoba靶向CTSC抑制NET介导的神经炎症，突出其治疗潜力及天然活性成分的转化价值。

研究背景方面，陈年大蒜为鲜蒜经60°C–80°C、70%–90%相对湿度连续60–90天发酵所得，已有证据显示其提取物在卒中、阿尔茨海默病等神经系统疾病中具有神经保护作用，但关键活性成分及其精确分子机制尚不明确，且鲜蒜辛辣和胃肠刺激限制临床转化。ICH具有高死亡率和高致残率，血肿形成后触发免疫激活、氧化应激和炎症级联，现有治疗并发症风险高、神经功能恢复疗效有限，缺乏安全、低毒且精准靶向免疫炎症通路的干预手段。NETs被认识为驱动ICH后神经炎症和继发性脑损伤的关键介质，过度NET形成可加重炎症、破坏BBB、损害血肿清除。基于上述问题，Junjun Meng等从陈年大蒜中鉴定新型成分Efoba，建立可规模化合成路线，并通过多组学筛选发现CTSC为直接靶点，进而系统验证Efoba通过稳定小胶质细胞溶酶体膜、抑制CTSC释放、阻断NET形成而减轻ICH后继发性脑损伤。该文发表于《Advanced Science》，为陈年大蒜来源神经保护剂的靶点阐明和转化开发提供实验依据。

关键方法包括：LC-MS/MS非靶向代谢组学比较陈年大蒜与鲜蒜，经柱层析和半制备液相分离，以HRESIMS、NMR和FT-IR鉴定Efoba并建立化学全合成；在SPF雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，20 g ± 3 g）建立胶原酶诱导ICH模型，原代小胶质细胞取自新生小鼠（postnatal days 1–4），原代中性粒细胞取自8周龄雄性C57BL/6小鼠外周血，BV2细胞系购自中国科学院细胞库；采用Lip-MS、高通量虚拟筛选（high-throughput virtual screening, HTVS）、RNA-seq、蛋白质组学和空间蛋白质组学筛选靶点，以分子对接、分子动力学模拟、微量热泳动（microscale thermophoresis, MST）和表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）验证结合；通过Transwell共培养、条件培养基、CTSC敲除/过表达、重组小鼠CTSC（rmCTSC）救援及AZD7986、GSK484干预，结合透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）、MRI、脑含水量、行为学和组织学评价。

研究结果如下。2.1 新型天然成分Efoba的发现：通过非靶向代谢组学发现陈年大蒜与鲜蒜代谢谱显著分离，差异代谢物富集于氨基酸代谢、萜类与醌合成、苯丙烷生物合成等通路；经分离纯化获得淡黄色无定形粉末Efoba，HRESIMS给出m/z 327.0869 [M-H]^?，结合NMR确定分子式为C₁₈H₁₅O₆，结构为2-E-feruloyloxybenzeneacetic acid ester；建立化学全合成路线，百克级制备纯度超过98%，光谱与天然分离物一致。2.2 Efoba在ICH小鼠中发挥神经保护作用：急性毒性实验显示40–960 mg kg^?1剂量下无死亡和明显毒性，体重无显著差异，高剂量仅见轻度肝脏应激，凝血指标无显著改变；Efoba可跨BBB分布入脑，不加重早期出血或改变原发血肿体积；剂量依赖性减小血肿体积、促进皮质血流恢复、减轻神经元损伤和凋亡、保护紧密连接蛋白、改善BBB超微结构、促进髓鞘再生和轴突修复，并改善mNSS、Morris水迷宫、转棒、旷场和高架十字迷宫表现，促进血肿吸收和减轻脑水肿。2.3 Efoba通过抑制ICH后小胶质细胞活化发挥免疫调节作用：RNA-seq显示ICH上调免疫和炎症通路，Efoba显著下调细胞因子-受体互作、NF-κB、NET形成、TNF信号和溶酶体等通路；免疫荧光和Sholl分析显示Efoba抑制小胶质细胞激活、保留分支形态，减少CD86⁺/Iba1⁺双阳性细胞及CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β表达，并减少中性粒细胞浸润。2.4 Efoba通过靶向CTSC发挥神经保护作用：蛋白质组学、RNA-seq、Lip-MS和HTVS交集获得CTSC与CTSS，CTSC在Lip-MS结合信号和HTVS预测中更显著，且Efoba逆转ICH诱导的CTSC蛋白升高；分子对接提示Efoba结合pro-CatC激活区并阻碍CatS介导的pro-CatC活化，分子动力学显示Efoba-CTSC复合物稳定，MST和SPR证实直接结合，确定CTSC为直接靶点。2.5 Efoba通过稳定溶酶体膜抑制小胶质细胞来源CTSC释放：ICH后脑组织CTSC上调并被Efoba抑制；免疫荧光共定位显示CTSC主要与TMEM119⁺ resident microglia共定位，与MPO⁺中性粒细胞、CD31⁺内皮细胞、Olig2⁺少突胶质细胞、NeuN⁺神经元和GFAP⁺星形胶质细胞重叠很少；AO染色、Galectin-3与LAMP1共定位、溶酶体/胞质分离Western blot和ELISA表明OxyHb诱导溶酶体膜通透性增加和CTSC释放，Efoba维持溶酶体膜稳定性并减少CTSC胞质泄漏和分泌。2.6 ICH后CTSC表达与NET形成相关：RNA-seq和GSEA显示ICH后NET形成通路显著上调，CTSC为前沿上调基因之一；SEM见ICH脑组织NETs，Efoba处理下调NET形成基因集并减少NET结构；空间蛋白质组学显示ICH后CTSC、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）和Ly6G空间距离缩短、共定位增强，Efoba逆转这些空间耦合，降低炎症亚群比例。2.7 Efoba通过抑制小胶质细胞来源CTSC介导的NET形成发挥神经保护作用：Transwell共培养显示OxyHb诱导的小胶质细胞通过CTSC促进中性粒细胞NETosis，Efoba减少SYTOX Green⁺ NET结构、MPO/CitH3共定位、dsDNA、MPO-DNA复合物及瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3, CitH3）和PAD4表达；分区预处理洗脱和条件培养基实验表明小胶质细胞为主要靶细胞，rmCTSC可恢复NET形成；CTSC敲除取消Efoba的额外抑制作用，CTSC过表达则逆转Efoba对NETosis的抑制，证明其作用依赖CTSC。2.8 Efoba靶向CTSC抑制ICH后NET形成：体内给予梯度剂量Efoba和CTSC抑制剂AZD7986，Efoba剂量依赖性降低CTSC、CitH3、PAD4和Ly6G相关NET形成，减少CitH3⁺Ly6G⁺中性粒细胞比例及CTSC与NET共定位；rmCTSC救援可消除Efoba改善脑水肿、感觉运动功能和组织损伤的作用；PAD4抑制剂GSK484单用改善ICH损伤，但与Efoba联用无额外叠加保护，表明Efoba通过抑制CTSC减少NET形成而发挥神经保护。

讨论部分总结：该研究强调小胶质细胞激活与中性粒细胞浸润及NET形成是ICH后继发性神经炎症的关键级联，并首次将小胶质细胞来源CTSC定位为连接小胶质细胞激活与中性粒细胞NETosis的核心上游介质；CTSC敲除和过表达的正反向证据、空间蛋白质组学所揭示的CTSC-NE-Ly6G空间耦合及Efoba的逆转作用，共同支持CTSC-NET轴。Efoba还改善脑血流、脑水肿、紧密连接、髓鞘和轴突损伤及多种行为学结局，且可跨BBB、低细胞毒性。讨论同时指出局限：体内疗效和安全性仅在小鼠ICH模型评价，年龄相关合并症影响尚待明确；CTSC可能不是唯一靶点，其他平行通路或其他高排名Lip-MS候选蛋白可能参与多药理效应；Efoba的构效关系、代谢稳定性和药代动力学仍需系统研究。研究结论翻译：综上，该研究证明陈年大蒜来源的新型生物活性成分Efoba对ICH后脑损伤发挥神经保护作用。重要的是，研究人员建立了Efoba的可规模化全合成路线，解决天然产物研究中天然丰度有限和样品不足的常见瓶颈。机制上，Efoba稳定小胶质细胞溶酶体膜，抑制CTSC释放，进而抑制NETs形成，从而有效阻断CTSC-NET通路。这些发现首次阐明Efoba的神经保护机制，并为其通过抑制CTSC减轻ICH后继发性脑损伤的治疗潜力提供关键证据，尽管其临床应用仍需进一步研究。值得注意的是，CTSC可能并非Efoba的唯一靶点，因为该化合物可能通过调节其他平行通路发挥协同神经保护作用。因此，该研究对数据进行了严格解释，未将CTSC过度表述为Efoba的唯一靶点。该工作不仅为探索Efoba的治疗潜力开辟新途径，也强调阐明其多靶点机制对扩展ICH治疗应用的重要性。