《Advanced Science》：Integrated Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal Convergence on a Senescence-Associated B Cell–MIF Signaling Axis in Joint Aging and Osteoarthritis Progression
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骨关节炎（OA）涉及与年龄相关的结构和免疫改变，但衰老相关B细胞状态是否促进软骨退变尚不清楚。研究人员对健康、衰老及OA小鼠关节进行整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学分析，发现B细胞丰度降低，但富集一种低增殖性、炎症性状态，并伴有巨噬细胞
骨关节炎（OA）涉及与年龄相关的结构和免疫改变，但衰老相关B细胞状态是否促进软骨退变尚不清楚。研究人员对健康、衰老及OA小鼠关节进行整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学分析，发现B细胞丰度降低，但富集一种低增殖性、炎症性状态，并伴有巨噬细胞移动抑制因子（MIF）信号增强。细胞间通讯与空间配体–受体分析显示，邻近软骨的B细胞相关区域中MIF–CD74/CD44预测相互作用增强。组成性MIF缺失可减轻体内衰老相关B细胞改变、MMP13诱导及软骨损伤。来源于衰老和OA小鼠的关节B细胞通过MIF依赖性旁分泌信号诱导软骨细胞衰老，降低COL2A1和HMGB1，并增加FN1和MMP13。这些效应可被MIF中和所抑制，并在MIF缺陷共培养体系中由重组MIF恢复。研究人员构建了一种复合水凝胶，携带槲皮素和负载MIF-siRNA的PLGA微球以实现局部共递送。该微球在体外96 h内呈现siRNA的逐步释放。在DMM诱导的OA中，该制剂降低MIF、P16和MMP13信号，恢复HMGB1，并保护软骨。这些发现支持一种与关节衰老和软骨细胞功能障碍相关的衰老相关B细胞–MIF信号轴，并为一种基于局部生物材料、可减轻OA相关改变的策略提供了概念验证。
骨关节炎（OA）是一种与年龄相关的慢性关节疾病，以进行性软骨丢失和关节功能障碍为特征，全球患病人数超过5亿，是导致残疾的主要原因之一，并构成日益加重的公共卫生负担。尽管在定义OA相关分子通路方面已取得重大进展，但临床上有效的疾病修饰疗法仍然有限。这一治疗缺口可能部分反映了OA的复杂性——其并非由单一通路驱动，而是由受损结构组织与关节内失调细胞群体之间持续相互作用所致。应激与损伤相关信号可重塑细胞间通讯、维持炎症与分解代谢反应、招募免疫细胞并损害软骨细胞稳态。因此，识别疾病相关免疫细胞状态并明确其改变后的信号活动如何破坏软骨稳态，可能揭示新的致病机制和治疗靶点。免疫失调已在自身免疫性和炎症性关节炎中被广泛研究，而B细胞对OA的贡献仍不完全明确。近期研究表明，OA中B细胞的增殖能力和分化潜能发生改变。然而，这些改变究竟仅反映炎症性关节环境，还是代表一种主动促进软骨退变的衰老相关致病性B细胞状态，仍不清楚。明确衰老相关B细胞重塑是否驱动OA进展和关节衰老，可能揭示保护软骨稳态的新型免疫调节策略。巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一种多效性细胞因子，协调先天性和适应性免疫应答。在系统性红斑狼疮和多发性硬化症中，MIF促进B细胞存活、活化及炎症性细胞因子产生。MIF也涉及多种退行性疾病，并正作为治疗靶点进行研究。在小鼠脊柱关节炎模型中，MIF基因缺失可减轻疾病严重程度。然而其在OA中的作用尚不明确，因为实验研究得出了不一致的结论。这些观察促使研究人员检验MIF是否在OA关节内将疾病相关B细胞重塑与软骨退变偶联。单细胞RNA测序和空间转录组学为解析关节细胞异质性、状态转换、细胞间通讯和解剖学背景提供了互补方法。在此，研究人员将来自健康、自然衰老和内侧半月板失稳（DMM）诱导的OA小鼠关节的单细胞图谱与对照和晚期OA组织的空间转录组图谱进行整合，随后结合组织水平验证、组成性MIF缺失、关节来源B细胞–软骨细胞共培养、MIF中和及重组MIF回补，检验MIF是否介导衰老相关B细胞对软骨细胞的作用。基于所得到的机制，研究人员设计了一种双作用siMIF微球/槲皮素水凝胶（SQH），旨在调节衰老相关细胞状态，同时通过递送MIF-siRNA降低局部MIF表达。总之，研究数据识别出一条衰老相关B细胞–MIF轴，将关节衰老与软骨细胞功能障碍联系起来，并提供概念验证：联合调节细胞衰老和MIF信号可减轻OA进展。
2 结果
2.1 单细胞与空间转录组分析揭示OA进展和关节衰老过程中B细胞功能重编程及比例失衡
为表征与OA进展和关节衰老相关的细胞改变，研究人员对野生型对照小鼠、自然衰老小鼠及OA诱导后多个时间点小鼠的膝关节组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。同时，对对照和OA-24 W关节的代表性组织切片进行空间转录组分析。经质量控制和整合后，共分析246,877个细胞，并将其注释为八个主要群体，包括粒细胞样簇1（GL1）、B细胞、软骨细胞、粒细胞样簇2（GL2）、T细胞、红细胞、巨噬细胞和单核细胞。粒细胞样簇1以Retnlg、Mmp8和Mmp9为特征，B细胞表达Vpreb3、Cd79a和Ebf1。软骨细胞簇表达S100a4、Fn1和F13a1，粒细胞样簇2表达Elane、Fcnb和Prtn3。T细胞以Ccl5、Ms4a4b和Nkg7为标志，红细胞以Hbb-bs、Hba-a1和Hba-a2为标志。巨噬细胞以Vcam1、C1qa和Hmox1表达为特征，单核细胞簇表现出Apoe、Gngt2和Ear2。空间转录组区室注释进一步解析了主要解剖区域，包括骨骼肌/软组织、骨、滑膜、半月板、骨髓、生长板、软骨和软骨下骨。研究人员随后检查了OA进展和关节衰老过程中的细胞组成变化。各scRNA-seq样本的堆叠条形图显示关节主要细胞群体发生显著重塑，其中B细胞群体在衰老和OA组中变化尤为突出。UMAP投影同样显示OA进展和衰老过程中主要群体的进行性重分布，包括B细胞富集区域。衰老和晚期OA关节中B细胞丰度低于健康对照。为在组织水平进一步验证单细胞发现，研究人员对代表性30月龄（30 M）、对照和OA-24 W小鼠膝关节进行组织学和免疫荧光分析。由于Cd79a是公认的B细胞标志物，研究人员使用Cd79a染色和表达评估关节组织中的B细胞丰度。H&E和Safranin O/固绿染色证实衰老和OA关节中存在软骨损伤和基质丢失。免疫荧光显示病变组织中Cd79a阳性面积减少，同时FN1沉积增加。区室特异性定量显示，30 M和OA-24 W关节在滑膜、软骨下骨和骨髓中Cd79a阳性面积均低于对照，空间转录组学显示OA-24 W切片中Cd79a信号相应降低。在组织水平验证B细胞丰度降低后，研究人员利用GO和KEGG富集分析检查B细胞群体的疾病相关转录程序。B细胞差异表达基因富集于抗原加工与呈递、白细胞活化、T细胞活化调节及炎症通路（包括IL-17和JAK–STAT信号），与OA和衰老关节中的炎症活化状态一致。p53信号、凋亡信号调节、活性氧代谢和溶酶体相关过程的富集进一步提示细胞应激和衰老相关重塑。与这些发现一致，基因集富集分析显示IL-6–JAK–STAT3信号、经NF-κB的TNF-α信号和糖酵解呈正富集，而氧化磷酸化呈负富集，表明OA进展和关节衰老过程中B细胞发生协调的炎症和代谢重编程。这些数据建立了OA和衰老小鼠关节的单细胞与空间转录组图谱，并确定B细胞功能重编程和比例失衡是疾病进展和关节衰老的突出特征。
2.2 衰老相关B细胞转录状态伴随OA进展和关节衰老中的软骨细胞退变
为定义OA进展和关节衰老过程中的B细胞重塑，研究人员对整合单细胞图谱中的B细胞进行重新聚类。t-SNE可视化解析出15个转录 distinct 簇，并将其注释为12种B细胞亚型或状态，包括未成熟B细胞、初始B细胞、记忆B细胞、生发中心暗区B细胞、前B细胞、边缘区B细胞、浆细胞、浆母细胞、循环前B细胞、干扰素诱导B细胞、表达Top2a的B细胞和未分类B细胞。这些注释得到代表性亚型特异性标志基因的支持，如热图所示，簇水平注释总结和支持标志物见补充表S2。为评估B细胞亚型 representation 的鼠间一致性，研究人员进一步检查了这些亚型在个体动物中的分布和相对组成。基于图1中识别的应激和衰老相关特征，研究人员定义了一个九基因衰老相关转录基因集，包括细胞周期停滞相关基因（Cdkn1a、Cdkn2a、Cdkn2b和Rb1）、p53/DNA损伤应答相关基因（Trp53、Gadd45a和Gadd45b）以及衰老相关细胞表型相关基因（Btg2和Glb1）。这九个基因构成用于AUCell评分的完整基因集；其功能分类、纳入理由和支持参考文献见补充表S1。AUCell用于量化该预定义基因集在单个B细胞中的富集程度，AUCell评分越高表示衰老相关转录程序富集程度越高。对代表性切片中先前定义的Cd79a阳性B细胞相关斑点进行空间映射显示，OA-24 W切片中高衰老相关AUCell评分斑点的分布范围较对照切片更广。由于空间转录组学每种条件仅对一张切片进行，该空间模式被描述性解释为代表性解剖背景，而非生物学重复的组间差异证据。同时，来自30 M和OA-24 W scRNA-seq数据集的B细胞表现出高于健康对照数据集的衰老相关转录活性。总之，这些观察为OA进展和关节衰老过程中B细胞的衰老相关转录重塑提供了支持性证据。与代表性组中基于AUCell的衰老评分一致，所有OA和衰老组B细胞DEG的富集分析进一步支持衰老相关炎症改变。KEGG分析显示细胞衰老、细胞周期、FoxO信号和p53信号通路富集，GO分析突出氧化应激应答、炎症反应调节、白细胞介素-6产生和损伤DNA结合。GSEA进一步显示G2M检查点、E2F靶点和DNA修复通路显著下调，而炎症反应通路显著上调。总之，这些富集结果表明OA和衰老关节中的B细胞表现出衰老相关炎症转录特征，以增殖和基因组维持程序受抑以及炎症、氧化应激和DNA损伤应答特征增强为特点。为进一步解析OA进展和关节衰老过程中B细胞的动态重塑，研究人员沿包含三个推断状态的拟时序轨迹对B细胞进行排序。以State 2为根，轨迹经State 3延伸至State 1。沿此有序轨迹，细胞周期和增殖相关基因（包括Ccna2、Mki67、Pcna和Top2a）向State 1方向表达降低，表明增殖活性下降。同时，Hmgb1也沿State 1相关轨迹降低，与衰老和OA关节中HMGB1阳性细胞丢失一致。结合前述富集结果，这些基因表达动态支持State 1为衰老相关B细胞状态。值得注意的是，State 1 B细胞在衰老和OA关节中的 representation 较健康对照更突出，且在不同OA时间点间其相对 representation 存在差异。这些结果提示OA进展和关节衰老与低增殖、衰老相关B细胞转录状态的 representation 增加相关。重要的是，该拟时序排序代表B细胞状态间推断的转录关系，而非体内定向谱系转换的直接证据。为验证这些发现，研究人员对对照、30 M和OA-24 W小鼠膝关节切片进行免疫荧光染色。与对照相比，30 M和OA-24 W关节显示MMP13染色增加且MMP13荧光强度显著升高。相反，30 M和OA-24 W关节中HMGB1阳性B细胞和HMGB1阳性软骨细胞减少。HMGB1阳性B细胞的减少与拟时序相关的Hmgb1表达下降一致，而MMP13增加表明软骨退变活性增强。总之，这些发现表明OA进展和关节衰老以向衰老相关B细胞状态转变伴随软骨退变为特征。
2.3 OA和衰老关节中衰老相关B细胞与软骨细胞间MIF信号增强
鉴于衰老相关B细胞重塑伴随软骨退变，研究人员接下来研究特定细胞间信号通路是否连接这些过程。对代表性对照、30 M和OA-24 W组的CellChat分析鉴定出MIF是衰老和晚期OA数据集中预测细胞间通讯增加的途径之一。预测的MIF相关相互作用在多个群体中增加，其中30 M和OA-24 W关节中B细胞–软骨细胞通讯预测尤为显著。网络中心性分析进一步显示，在30 M和OA-24 W数据集中，B细胞在MIF通讯网络中的预测发送者和接收者中心性评分较高，提示B细胞可能参与MIF相关细胞间通讯。为检查计算预测的MIF相关相互作用的空间分布，研究人员在代表性对照和OA-24 W切片中映射MIF–CD74和MIF–CD44相互作用评分。在所分析切片中，OA-24 W切片显示更多高预测相互作用评分斑点，且MIF相关相互作用热点与衰老相关评分较高的B细胞相关区域之间表现出更明显的空间重叠或邻近。因此，这些观察为MIF相关CD74/CD44受体复合物信号在B细胞重塑和软骨退变相关区域中的预测参与提供了解剖背景。免疫荧光证实30 M和OA-24 W关节中MIF染色增加，伴随FN1沉积增加和B细胞分布改变。衰老和OA关节中MIF阳性B细胞比例也较高。为在全身和关节内水平进一步验证MIF上调，研究人员测量了血清和滑液中的MIF浓度。与对照小鼠相比，30 M和OA-24 W小鼠血清和滑液中MIF浓度均升高，表明关节衰老和OA进展过程中MIF的全身和局部上调。总之，这些结果支持OA和衰老关节中MIF丰度增加以及计算预测的MIF相关通讯增强。特别是，MIF阳性B细胞的积累、预测的MIF相关B细胞–软骨细胞通讯增强，以及预测的MIF–CD74和MIF–CD44相互作用活性与衰老相关B细胞和软骨区域的空间关联，支持衰老相关B细胞重塑与软骨细胞退变之间潜在的MIF中心连接。这些发现确定衰老相关B细胞–MIF轴是B细胞–软骨细胞串扰的候选介质。
2.4 遗传性MIF缺失减轻体内OA进展和衰老相关B细胞改变
鉴于在OA和衰老关节中观察到MIF信号增强，研究人员接下来检查遗传性MIF缺失是否减轻体内OA进展。在野生型（WT）和Mif?/?小鼠中建立DMM诱导的OA，并在术后8周和24周分析膝关节。基线表型显示Mif?/?小鼠体重和体长低于WT小鼠。WT和Mif+/?小鼠血清MIF浓度相当，而Mif?/?小鼠血清MIF水平几乎检测不到，证实MIF缺失有效。H&E和Safranin O染色膝关节的组织学分析显示，WT和Mif?/?对照小鼠软骨均完整。OA诱导后8周，WT小鼠表现出早期软骨损伤，而Mif?/?小鼠软骨退变较轻。至24周，WT小鼠出现广泛软骨侵蚀和基质丢失，而Mif?/?小鼠保持较好的软骨完整性。一致地，在OA诱导后8周和24周，Mif?/?小鼠终末OARSI组织学评分均显著低于WT小鼠，表明MIF缺失减少软骨损伤并减轻OA进展。免疫荧光染色进一步显示，WT小鼠OA关节中MIF和MMP13信号增加，尤其在24周时，而Mif?/?小鼠MIF染色几乎缺失且MMP13表达降低。这些结果提示MIF缺失减少OA进展过程中MMP13相关软骨降解。研究人员进一步检查关节组织内B细胞中MIF和HMGB1表达。WT OA关节显示MIF阳性B细胞比例增加和HMGB1阳性B细胞比例降低。相反，这些改变在Mif?/? OA关节中部分逆转，与WT OA关节相比，MIF阳性B细胞较少且HMGB1阳性B细胞恢复。总之，这些体内发现表明组成性全身MIF缺失与DMM诱导的软骨损伤减轻、MMP13表达降低及衰老相关B细胞标志物改变相关。由于MIF在整个生命过程中被全身性删除，这些发现不能将保护表型特异性归因于B细胞来源的MIF，也不能排除发育性、全身免疫或生物力学贡献。这些发现支持MIF在OA中的体内相关性，并促使研究人员进一步检查B细胞相关MIF是否促进软骨细胞退变。
2.5 衰老相关B细胞通过MIF依赖性信号在体外促进软骨细胞衰老和退行性重塑
为确定MIF缺失 conferred 的体内保护是否涉及B细胞–软骨细胞机制，研究人员研究OA和衰老相关B细胞是否通过MIF依赖性信号促进软骨细胞退变。研究人员建立Transwell共培养体系，使用原代软骨细胞和通过磁珠分选分离的小鼠关节来源B细胞。B细胞来自对照、OA-8 W、OA-24 W、Mif?/?和15月龄（15 M）小鼠。共培养前，研究人员首先表征这些B细胞群体的衰老表型和MIF产生。与对照来源B细胞相比，OA-8 W、OA-24 W和15M来源B细胞表现出P16和P21表达增加，其中OA-24 W和15 M组上调最明显。SA-β-gal染色进一步证实OA-24W和15M来源B细胞衰老表型更明显，而Mif?/? B细胞SA-β-gal阳性率与对照来源B细胞相当。OA-8 W、OA-24 W和15 M组B细胞培养上清中MIF浓度显著升高，而Mif?/? B细胞MIF分泌极少。总之，这些结果表明OA进展和衰老与MIF分泌增加的衰老相关B细胞积累相关。Transwell共培养后，暴露于OA-24W或15M来源B细胞的软骨细胞显示FN1和MMP13表达增加，同时COL2A1和HMGB1表达降低，表明软骨细胞稳态丧失及纤维化和退行性重塑增强。相反，与Mif?/? B细胞共培养的软骨细胞 largely 保留COL2A1和HMGB1表达，并显示FN1和MMP13诱导减少，提示MIF缺失减弱OA和衰老相关B细胞的促退变效应。一致地，OA-24 W和15M来源B细胞诱导明显的软骨细胞衰老，表现为P16和P21表达增加及SA-β-gal阳性率升高，而Mif?/? B细胞诱导的衰老相关改变 substantially 较轻。为检验MIF是否是OA来源B细胞诱导软骨细胞衰老的功能性必需因子，研究人员进行MIF阻断和回补实验。与在IgG对照存在下与OA-24W来源B细胞共培养的软骨细胞相比，抗MIF中和抗体处理显著降低P16和P21表达并减少SA-β-gal阳性软骨细胞比例。抗MIF处理将这些衰老标志物降低至与对照或Mif?/? B细胞共培养观察到的水平相当。相反，重组MIF回补恢复了Mif?/? B细胞促进软骨细胞衰老的能力，导致P16和P21表达增加和SA-β-gal阳性率升高。总之，这些功能缺失、中和和回补实验支持细胞外MIF在体外介导OA和衰老相关关节来源B细胞诱导的软骨细胞衰老相关和退行性改变中的作用。
2.6 基于衰老相关B细胞–MIF轴构建和表征双作用SQH水凝胶
总之，研究人员的单细胞、空间、体内和体外分析支持一种病理模型：OA进展和关节衰老驱动衰老相关B细胞重塑。在病变关节中，软骨基质破坏和抗原刺激与B细胞功能改变相关，包括增殖特征降低和炎症活化增强。这些发现提示衰老相关B细胞重塑伴随MIF信号增加，并可能促进软骨细胞衰老相关和退行性改变。这些发现为开发一种旨在调节衰老相关细胞改变同时降低局部MIF表达的复合治疗策略提供了依据。基于该衰老相关B细胞–MIF–软骨细胞轴，研究人员选择槲皮素调节OA进展过程中的衰老相关表型，并掺入负载MIF-siRNA的PLGA微球以降低骨关节炎关节内MIF表达。因此，研究人员通过将两种组分掺入水凝胶基质构建了复合siMIF微球/槲皮素水凝胶（SQH）。该双作用系统设计为结合槲皮素介导的衰老相关表型调节与通过MIF-siRNA递送的局部MIF降低。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，空载和负载siMIF的PLGA微球均呈均匀球形形态，粒径主要在3至6 μm范围内，平均直径低于5 μm。体外释放分析显示siMIF从PLGA微球中在测量的96小时区间内逐步释放。罗丹明标记的siMIF微球在交联水凝胶内均匀分布，证实微球成功掺入水凝胶基质。荧光成像显示siMIF微球来源信号与鬼笔环肽染色的软骨细胞空间紧密相关，而siMIF微球处理降低培养软骨细胞中MIF免疫荧光。UV交联前，SQH制剂表现出热响应行为，在25°C以下更像固体，在37°C及以上变为液体样。预交联SQH的温度扫描流变分析显示储能模量（G′）随温度依赖性降低，G′与损耗模量（G″）在约35°C交叉，与加热过程中凝胶到溶液的转变一致。该制剂随后在紫外光下交联以生成用于关节内注射的最终SQH，其在光学显微镜下保持良好结构完整性。与不同水凝胶制剂共培养的软骨细胞未显示明显形态异常，荧光成像显示siMIF微球来源信号与培养软骨细胞空间紧密相关。免疫荧光染色进一步显示SQH共培养组MIF信号降低。总之，这些结果证明SQH的热响应特性、在所检查条件下与培养软骨细胞的相容性、局部siMIF递送以及SQH处理后MIF免疫荧光降低。
2.7 SQH水凝胶对衰老相关B细胞–MIF轴的双作用调节减轻OA进展
基于上述构建和表征的双作用SQH水凝胶，研究人员接下来评估其在体外和体内减轻MIF相关软骨细胞退变和OA进展的能力。体外，OA软骨细胞用不同水凝胶制剂处理，包括槲皮素水凝胶（QH）、siMIF微球水凝胶（SH）和联合siMIF微球/槲皮素水凝胶（SQH）。在所测试制剂中，SQH在所评估的OA相关软骨细胞标志物中表现出最有利的总体特征。与未处理OA软骨细胞和QH处理细胞相比，SQH显著降低MIF和MMP13表达。SQH处理还降低OA软骨细胞中P16表达并恢复HMGB1表达，表明联合槲皮素/siMIF制剂在体外减轻MIF相关分解代谢和衰老相关改变。随后在DMM诱导的OA小鼠模型中评估SQH的治疗功效。小鼠在术后第14、28和42天接受单独水凝胶或SQH关节内注射，相当于以两周间隔三次注射，并在DMM术后24周收获膝关节进行终末分析。H&E和Safranin O/固绿染色显示OA和单独水凝胶组严重软骨侵蚀和基质丢失，而SQH治疗保持软骨结构和Safranin O染色。一致地，SQH组24周终末OARSI组织学评分显著低于单独水凝胶组，表明在所检查终点组织学OA严重程度降低。免疫荧光染色进一步显示SQH治疗的OA关节中MMP13表达降低和HMGB1信号恢复，支持软骨退变和衰老相关改变减少。此外，OA和单独水凝胶关节中MIF免疫荧光较高，但在24周终点SQH治疗关节中降低。与OA和单独水凝胶组相比，SQH治疗关节中HMGB1阳性B细胞比例也增加，与24周终点衰老相关B细胞改变减轻一致。总之，这些发现表明SQH治疗与衰老相关B细胞改变减轻、MIF免疫荧光降低和软骨退变减少相关。
3 讨论
在本研究中，研究人员系统分析了OA和衰老小鼠膝关节的细胞和分子改变，重点关注B细胞和MIF信号。单细胞转录组学揭示关节微环境 substantial 重塑，包括B细胞丰度降低和结构细胞区室显著改变。值得注意的是，衰老相关B细胞重塑伴随MIF丰度增加以及OA和衰老关节中计算预测的MIF相关与软骨细胞通讯增强。这种免疫–结构细胞串扰与软骨细胞促炎和分解代谢改变、软骨细胞外基质稳态破坏及软骨降解加速相关。MIF基因缺失和抗体介导阻断减轻这些病理改变，支持MIF在OA进展中的功能作用。基于这些发现，研究人员设计了一种双作用SQH水凝胶，结合衰老细胞清除剂槲皮素与负载MIF-siRNA的微球。这种方法减轻软骨细胞退变、减少细胞衰老，并有助于恢复更稳态的B细胞–软骨细胞信号环境。B细胞是适应性免疫的核心组分，产生抗体并调节免疫应答。衰老或功能失调B细胞通常以细胞周期停滞、代谢和增殖能力降低、促炎介质产生及B细胞亚群组成失衡为特征。此类改变已被认为涉及退行性和炎症性疾病。然而，在OA中，B细胞的贡献仍不完全清楚。研究人员的数据提示OA中B细胞经历衰老相关重塑，表现为丰度降低、转录状态改变和关节组织内增殖程序受损。此外，OA中浆细胞相关亚群比例增加与先前关于OA中B细胞扩增和浆细胞分化改变的报道一致。这种分化偏倚可能源于炎症性关节微环境中的持续刺激，其中软骨降解产物和细胞因子如IL-6和TNF-α可激活B细胞受体或Toll样受体并促进浆细胞发育。抗体分泌和促炎细胞因子释放可能进一步加剧局部炎症、破坏软骨基质稳态并加速软骨细胞功能障碍。这些观察将衰老相关B细胞重塑定位为OA病理的潜在免疫驱动因素。研究支持MIF在OA相关软骨退变中的作用，尽管其效应似乎具有背景依赖性。先前研究关于MIF在OA中的作用报道了不一致的发现。Rowe等显示Mif缺失减少老年小鼠自然发生的年龄相关OA，而Mif缺失或全身MIF中和在年轻成年小鼠DMM模型中均未产生 comparable 保护。相反，研究人员在本研究使用的条件下观察到组成性Mif?/?小鼠DMM相关软骨病理减轻。动物年龄、性别、遗传背景、DMM操作、实验终点和组织学评分方法的差异可能导致这些看似不同的结果。因此，这些发现提示MIF对OA的贡献可能因疾病背景和实验设置而异，而非代表跨模型的统一效应。有趣的是，同一研究还报道人OA软骨细胞较正常软骨细胞MIF分泌增加，提示MIF的贡献可能取决于疾病背景和局部细胞来源。相反，Liu等报道终末期OA患者循环MIF蛋白水平较低且关节软骨MIF mRNA表达降低，因此提出MIF可能具有保护作用。然而，该结论主要基于横断面关联而非对MIF的直接功能操作，且该研究中软骨MIF表达与循环MIF水平不相关。这些观察提示循环MIF、 bulk 软骨MIF表达和特定细胞区室内局部产生的MIF可能代表MIF信号生物学上不同的方面。从这个角度看，研究人员识别衰老相关B细胞中MIF产生增强以及OA和衰老相关B细胞对软骨细胞的MIF依赖性效应，提供了一个细胞分辨的机制框架，可能有助于调和这些看似不同的发现。机制上，衰老相关B细胞产生的MIF可能结合软骨细胞上的CD74-CD44受体复合物并激活下游炎症通路，包括NF-κB信号。这可能增加促炎细胞因子如IL-1β和IL-6以及基质降解酶如MMP13和MMP9，从而促进衰老相关分泌表型并加速基质降解。同时，MIF可能通过NADPH氧化酶激活和线粒体功能障碍增强氧化应激，增加活性氧和DNA损伤应答。过量ROS可强化MIF分泌和NF-κB激活，形成自我放大环路，加剧炎症、线粒体应激和软骨细胞衰老。因此，靶向MIF-NF-κB-ROS轴可能是中断OA相关炎症性衰老的合理策略。MIF与B细胞之间的相互作用也可能涉及自分泌和旁分泌反馈。B细胞可产生MIF并表达MIF受体，使MIF信号相互放大。先前研究表明MIF通过CD74-CD44受体复合物和NF-κB激活促进B细胞存活。在炎症性关节炎中，NF-κB信号维持B细胞存活并促进促炎细胞因子分泌，导致滑膜炎症和软骨损伤。这些观察支持一种双作用治疗策略，同时抑制上游B细胞衰老和下游MIF信号。与新兴的用于局部调节骨关节炎关节微环境的多功能生物材料策略一致，本研究使用结合槲皮素与负载MIF-siRNA的PLGA微球的SQH水凝胶进行局部复合递送。PLGA微球在测量的96小时体外区间内显示siMIF逐步释放，而槲皮素可能调节衰老相关B细胞改变及相关炎症反应。体内，SQH治疗与终末终点MIF免疫荧光降低相关。通过减轻B细胞衰老、限制过度浆细胞分化并抑制MIF–CD74/CD44-NF-κB信号，SQH水凝胶可能减少炎症细胞因子和基质降解酶产生、保持软骨稳态并延缓OA进展。总之，研究人员的发现确定衰老相关B细胞是通过MIF驱动软骨细胞退变介导OA的关键介质。中和MIF或抑制MIF信号可减轻关节炎症、减少B细胞衰老并保持软骨完整性。SQH通过减轻衰老相关B细胞改变和抑制关节内MIF信号提供了一种双作用治疗策略，从而减少软骨细胞退变和OA进展。未来研究应致力于解析骨关节炎背景下其他免疫细胞和细胞因子 orchestrated 的复杂细胞间信号网络。
4 材料与方法
4.1 实验设计
本研究整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学、组织水平验证、基于细胞的功能测定、遗传性MIF缺失和生物材料干预，以定义衰老相关B细胞–MIF轴在骨关节炎（OA）进展和关节衰老中的作用。发现队列包括24个小鼠膝关节样本，来自健康对照、自然衰老小鼠（15和30月龄）和内侧半月板失稳（DMM）诱导的OA小鼠（术后2、4、8、12或24周收集）。通过scRNA-seq表征主要关节细胞群体和B细胞状态；计算和空间评估以MIF为中心的细胞间通讯；并在MIF缺陷小鼠、关节来源B细胞–软骨细胞共培养、MIF中和和重组MIF回补实验以及siMIF微球/槲皮素水凝胶（SQH）治疗中检验机制相关性。动物在干预前分配至实验组，组织处理、图像采集和结果评估使用匹配方案。组织学评分和定量图像分析由对组别身份不知情的研究人员进行。对于所有体内、基于组织和样本水平的单细胞转录组比较，个体小鼠被定义为生物学实验单位。来自同一小鼠的多个切片、感兴趣区域、显微镜视野或细胞被视为技术或嵌套观察，并在组间统计分析前在每只小鼠内汇总。因此，除非另有说明，每个显示的数据点代表一只小鼠。技术重复不被视为独立生物学重复。对于生物学重复水平评估，细胞水平衰老AUCell评分通过计算每只小鼠B细胞的平均评分进行汇总。
4.2 单细胞文库制备、测序和预处理
使用10x Genomics Chromium Single Cell 3′ Gene Expression平台生成单细胞3′基因表达文库。文库在Illumina平台上使用双端测序进行测序。原始FASTQ文件使用Cell Ranger（版本5.0.0）处理，并比对到小鼠GRCm38/mm10参考基因组以生成基因–条形码表达矩阵。每只小鼠作为独立生物学样本处理，样本身份在整个质量控制和多样本整合过程中保留。环境/背景RNA污染在下游分析前使用CellBender校正。基于UMI计数、检测基因数以及线粒体和核糖体转录本比例对每个样本分别进行质量控制。红细胞相关转录本比例>1%的细胞被排除，最大线粒体转录本阈值上限为25%。预测的双细胞使用Scrublet识别并去除。质量控制后，为每个样本识别前2,000个高变基因。进行主成分分析，并使用Harmony进行多样本整合和批次效应校正。保留前20个主成分用于下游聚类。使用Louvain算法进行基于图的聚类，整合数据使用t-SNE和UMAP可视化。
4.3 单细胞悬液制备
在无菌条件下，使用无菌手术剪新鲜获取小鼠膝关节组织。组织用RPMI 1640冷培养基加0.04%牛血清白蛋白（BSA）洗涤两次。随后，用手术剪将组织切成0.5 mm3碎片，并在新鲜制备的含1 mg/ml IV型胶原酶的DMEM（补充5%胎牛血清（FBS））中培养。在恒温培养箱中37°C消化30–60分钟，每5–10分钟轻轻翻转以促进解离。消化后，细胞悬液通过40 μm BD细胞滤器过滤一至两次以去除碎片和未消化组织。过滤后的悬液在4°C以300 × g离心5分钟。获得的细胞沉淀用适当体积培养基重悬，并与红细胞裂解液（MACS，目录号130-094-183）1:1混合。混合物在4°C孵育10分钟以裂解红细胞。细胞以300 × g离心5分钟并弃去上清。沉淀用培养基洗涤一次并在相同条件下再次离心以去除上清。最后，细胞沉淀用100 μL培养基重悬，细胞浓度和活力由Luna自动细胞计数仪评估。
4.4 细胞聚类和细胞类型注释
用于细胞类型注释的簇富集标志基因使用Seurat中的FindMarkers函数通过Wilcoxon秩和检验识别。log折叠变化>0.25且在相应簇内至少20%细胞中表达的基因被视为代表性簇标志物。这些细胞水平标志物分析用于描述性簇注释，不被视为生物学重复水平的差异表达分析。归一化富集评分跨簇进行z标准化，并使用ComplexHeatmap（v2.14.0）可视化。细胞类型注释使用SingleR（版本1.4.1）结合MouseRNAseqData参考数据集、簇特异性标志基因表达和文献整理的谱系标志物进行。SingleR基于的分配与标志基因表达模式交叉核对，并使用互补的基于SCINA的半监督注释评估注释一致性。对于联合注释证据不足以支持确定谱系身份的簇，分配中性转录标签。
4.5 小鼠水平伪批量差异表达分析
对于B细胞的跨条件差异表达分析，个体小鼠被视为生物学实验单位。从非整合RNA assay中提取B细胞的原始UMI计数，并通过汇总该动物所有B细胞的基因计数为每只小鼠分别聚合，从而生成每只小鼠一个伪批量表达谱。Harmony校正的表达值用于降维和可视化，但不用于伪批量差异表达检验。伪批量计数矩阵使用edgeR分析。低表达基因使用filterByExpr去除，文库大小差异使用修剪均值M值（TMM）方法归一化。拟合负二项广义线性模型，以实验组为解释变量，并使用准似然框架评估差异表达。每个OA或衰老组与对照组之间的比较使用预设对比进行。每组内三只个体小鼠在整个分析过程中保留为独立生物学重复。P值使用Benjamini–Hochberg程序进行多重检验校正。调整后p值<0.05且绝对折叠变化>1.5的基因被视为差异表达。小鼠水平伪批量差异表达结果用作下游跨条件富集分析的输入。来自每个预设OA或衰老 versus 对照对比的显著伪批量DEG用于GO和KEGG过表征分析。基因宇宙定义为伪批量表达过滤后保留并在相应差异表达对比中测试的所有基因。GO和KEGG富集分析使用clusterProfiler进行，使用基因本体（GO；版本v2021.0918）和京都基因与基因组百科全书（KEGG；版本v2021.09）数据库。富集分析的P值使用Benjamini–Hochberg程序进行多重检验校正，调整后p<0.05视为显著。对于预排序GSEA，相应伪批量对比中测试的所有基因根据log2折叠变化排序。正归一化富集评分（NES）表示向OA或衰老组富集，而负NES值表示向对照组富集。GSEA p值使用Benjamini–Hochberg程序校正。
4.6 基于AUCell的衰老相关转录评分
使用包含九个基因（Cdkn1a、Cdkn2a、Cdkn2b、Trp53、Rb1、Gadd45a、Gadd45b、Btg2和Glb1）的衰老相关基因集进行AUCell评分。使用B细胞Seurat对象的RNA assay，并使用GetAssayData提取原始计数矩阵。评分前排除表达矩阵中缺失的基因。使用AUCell_buildRankings为每个细胞生成基因表达排名，并使用AUCell_calcAUC计算AUCell评分，aucMaxRank设置为ceiling(0.05 × N)，其中N表示表达矩阵中基因总数。使用随机种子123以确保可重复性，其他AUCell参数保持默认设置。所得AUCell评分被视为连续测量，评分越高表示预定义衰老相关转录基因集富集程度越高。未使用二元截断值将单个B细胞分类为衰老或非衰老。
4.7 细胞–细胞相互作用分析
细胞–细胞配体–受体相互作用分析使用CellChat R包（版本1.1.3）进行。首先导入归一化表达矩阵，并使用createCellChat函数创建CellChat对象。使用identifyOverExpressedGenes、identifyOverExpressedInteractions和projectData函数以默认参数进行预处理。随后使用computeCommunProb、filterCommunication和computeCommunProbPathway函数推断潜在配体–受体相互作用。最后，使用aggregateNet函数聚合总体细胞–细胞通讯网络。
4.8 拟时序轨迹分析
使用Monocle（版本2.14.0）对B细胞进行拟时序轨迹分析。将细胞组织为CellDataSet对象，并使用标准Monocle工作流程沿推断的转录轨迹排序。使用DDRTree算法以默认参数进行降维和轨迹重建。State 2被指定为参考根，主要基于增殖和细胞周期相关基因Ccna2、Mki67、Pcna和Top2a的表达模式，这些模式与相对增殖性转录状态一致。Hmgb1表达作为沿推断轨迹的状态相关特征额外检查。随后相对于该参考根按拟时序对细胞排序。所得轨迹被解释为推断的转录拓扑，而非体内谱系转换的直接证据。
4.9 空间转录组可视化
空间转录组学在来自独立小鼠的一张对照膝关节切片和一张OA-24 W膝关节切片上进行（每种条件生物学n=1）。因此，这些空间数据集用于提供代表性解剖背景，并支持而非独立建立对照和OA关节之间的组间差异。来自对照和OA-24 W小鼠膝关节的空间转录组数据使用通用工作流程处理和归一化。归一化基因表达值映射到其对应空间坐标并叠加在组织图像上。为Cd79a和MIF生成空间特征图。具有可检测Cd79a表达的斑点被操作性地定义为B细胞相关斑点用于空间可视化。由于单个Visium斑点可能包含多种细胞类型，该 designation 用于指示含有B细胞相关转录信号的候选区域，而非纯B细胞群体或MIF的细胞特异性来源。空间分辨配体–受体相互作用使用stLearn（版本1.2.2）及其空间约束配体–受体置换框架分析。文献整理的小鼠配体–受体对从connectomeDB2020_lit数据库使用species = "mouse"获取。斑点水平配体–受体评分使用st.tl.cci.run计算，min_spots = 20，distance = None，n_pairs = 10,000，random_state = 0。当distance = None时，每个空间邻域由焦点Visium斑点及其紧邻斑点组成。对于每个配体–受体对，每个斑点的观察空间评分与从10,000个非相互作用基因对生成的背景分布比较，这些基因对选择为具有与相应配体和受体基因相当的表达分布。P值使用Benjamini–Hochberg方法通过st.tl.cci.adj_pvals校正，设置correct_axis = "spot"，adj_method = "fdr_bh"，pval_adj_cutoff = 0.05。调整后p<0.05的斑点被视为显著配体–受体热点。这些调整后p值反映所分析切片内的
