《Advanced Science》：The Interplay Between Molybdopterin Synthase and Metal Metabolism Contributes to Pathogenicity in Acinetobacter baumannii
钼酶（molybdoenzymes）广泛存在于细菌、古菌及真核生物中，参与大量必需的氧化还原活动。钼辅因子（molybdenum cofactor, Moco）是一种基于蝶呤的催化剂，其合成由钼蝶呤合酶（molybdopterin synthase）即异四聚体MoaE-MoaD酶完成。研究证明，鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中的钼蝶呤合酶在细菌生长、形态决定、ROS耐受、生物膜形成以及除钼之外其他金属离子的代谢与稳态互作中发挥重要作用。此外，解析了MoaDE复合物的晶体结构，揭示MoaE中存在一段内在无序的富组氨酸C端尾，该尾在金属螯合及调节蛋白稳定性方面具有活性。鲍曼不动杆菌MPT合酶与毒力相关，并在大蜡螟（Galleria mellonella）及小鼠肺炎模型中得到验证。该研究揭示了细菌钼蝶呤合酶的结构与功能多样性，并探索了不同金属稳态通路之间的交互作用，为抗菌药物研发提供了潜在可能。
细菌要在宿主体内生存，必须能够夺取稀缺的营养物质，包括铁、锌、镍和钼等过渡金属元素。含钼酶广泛存在于细菌、古菌和真核生物中，在细菌中已鉴定出50多种不同类型的含钼酶，参与碳、氮、硫代谢相关的关键氧化还原反应。钼以钼酸盐（molybdate）形式具有生物可利用性，细菌通过高亲和力的ABC型ModABC转运系统摄取钼酸盐，而真核生物则存在MFS型钼酸盐转运蛋白如MOT1和MOT2。钼进入细胞后主要与钼蝶呤（molybdopterin, MPT）的顺式二硫烯基团结合形成钼辅因子（Moco），另一种掺入方式是仅存在于少数物种细菌固氮酶中的独特铁钼辅因子（FeMoco）。Moco不稳定，必须在体内新合成。大肠杆菌中的合成途径始于由5'-GTP形成环状吡喃蝶呤单磷酸（cPMP，前体Z），随后插入两个硫原子生成MPT，再腺苷化生成MPT-AMP，最终共价掺入钼生成Moco。该生物合成途径古老且在包括人类在内的所有生物中高度保守。抗疟药蒿甲醚靶向Moco生物合成级联，人类MPT合酶突变会导致Moco缺乏症，引起小头畸形和癫痫。
向钼蝶呤中插入顺式二硫烯基团的第二步反应由MPT合酶催化，该酶是由中心的MoaE二聚体及两侧各一个MoaD单体组成的异四聚体酶，两者均由moa操纵子编码。该反应是一个动态过程，每个MoaE单体结合一分子cPMP，MoaD在多个不同蛋白间循环，依次向MoaE结合的cPMP添加两个硫原子。来自半胱氨酸的硫原子由半胱氨酸脱硫酶IscS转移至TusA，再递送至先前由MoeB激活的MoaD羧基端二甘氨酸基序。在向cPMP添加第一个硫代羧酸硫原子形成半硫代中间体后，MoaD从MPT合酶复合物解离，随后引入一个含有额外硫代羧酸基团的新MoaD（MoaD-SH）至复合物，添加第二个硫原子以完成MPT。
MPT合酶的组装与活性可被精细调控以优化环境适应。MPT合酶通常由moa操纵子内两个独立基因moaD和moaE编码，而在致病性分枝杆菌中，moaX以单一融合多肽编码MoaD和MoaE结构域，需要翻译后切割成独立亚基才能具有完整MPT合酶活性。在耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）中也发现了由JAMMDR切割的类似融合MPT。在结核分枝杆菌中阐明了三种MoaE和MoaD同源物，其微小序列变异显示出不同的结合界面特征，结构重排导致酶失活。MPT合酶与ROS耐受密切相关，DrmoaE可被H2O2处理上调，且缺陷型DrmoaE在此类条件下减弱细菌生长。融合构建体的存在可能说明两个亚基协调表达的重要性，本研究将对此进行检验。
Moco生物合成与Fe-S簇合成紧密相连，这与自然界中钼与铁之间交互作用的诸多实例相一致。例如，负责Moco生物合成第一步的S-腺苷-L-甲硫氨酸酶MoaA是存在于生命三域中的含Fe-S蛋白。IscS既为含Fe-S簇蛋白的Fe-S簇组装动员硫原子，也为MPT的二硫烯基团提供硫。除Moco外，某些钼酶复合物的催化亚基还含有Fe-S簇或血红素。周质钼酸盐结合蛋白ModA也与铁摄取存在交互作用。然而，目前尚无证据表明钼蝶呤合酶（MPT synthase）直接参与铁代谢。
研究人员在MoaE中鉴定出一段富组氨酸C端尾，似乎能够结合过渡金属。金属离子与富组氨酸蛋白中咪唑环形成较强相互作用，这类蛋白近80%存在于细菌中，推测用于高亲和力清除。在枯草芽孢杆菌中，YrpE蛋白的(-XH-)n富组氨酸基序对锌离子具有高亲和力。Pht蛋白含有HxxHxH基序，控制Fe、Zn和Mn稳态及细菌毒力。在鲍曼不动杆菌中，MPT合酶MoaE的非经典富组氨酸C端尾在金属依赖性调控中的作用值得进一步研究。
鲍曼不动杆菌是一种医院获得性病原体，其可塑性基因组适应逆境和应激，使其能够在通常杀死所有其他细菌的抗生素治疗中存活。世界卫生组织（WHO）将碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）列为关键优先病原体，亟需新型治疗手段。MPT合酶是潜在的抗菌药物靶点，而MoaE在鲍曼不动杆菌中独有富组氨酸末端尾。研究人员观察了MPT合酶以及MoaE多聚组氨酸C端尾对细菌生理、生长、形态、ROS耐受和生物膜形成的影响，并进行转录组测序以进一步鉴定MPT合酶在碳、氮、硫代谢中的作用，区分MoaD与MoaE以及多聚组氨酸尾的影响。验证了金属离子与MoaE的相互作用并解析了MPT合酶晶体结构，通过SAXS证明MoaE富组氨酸C端尾的柔性。最后，在大蜡螟和小鼠急性肺炎感染模型中研究了MPT合酶的致病性。该工作表明MPT合酶是抗菌药物研发的潜在靶点。
2.1 MPT合酶影响鲍曼不动杆菌形态、ROS耐受、生物膜形成及金属离子稳态
鲍曼不动杆菌ATCC 19606的moa操纵子由moaA、moaC、moaD和moaE组成，两侧为与硝酸盐代谢相关的nir操纵子和与tRNA硫代化相关的tus操纵子。MoaD为84个氨基酸蛋白（GenBank登录号WP_001187658.1），MoaE为161个氨基酸蛋白（GenBank登录号WP_000657202.1）。通过Dali搜索对MoaE与最相似6个MoaE进行比对，显示羧基端存在独特的聚组氨酸尾。研究人员构建了序列相似性网络描述MoaD和MoaE的进化关系，MoaE相对保守位于中心附近，而MoaD位于边缘表现特异性，96.2%的MoaD同源物来自不动杆菌属，而71.4%的MoaE直系同源物属于不动杆菌属。MoaE与最相似6个结构的蛋白比对显示出非经典C端富组氨酸序列"HxHxHHHHxxHxHxH"，这种类似MoaE羧基端尾广泛存在于不动杆菌属中，组氨酸残基中位数为6，高于其他细菌属。富组氨酸蛋白在细菌感染宿主时提取金属元素方面发挥重要作用。研究人员设计了MoaE C端截短株（ECtrunc）以及moaD和moaE敲除与互补株（基因表达经qRT-PCR验证）用于细菌生理研究。
在LB培养基中培养，moaD（DK）或moaE（EK）敲除株较野生型（WT）、moaD（DC）或moaE（EC）互补株生长显著减弱，moaD缺失（DK）导致滞后期远长于moaE敲除（EK）。moaE敲除（EK）还降低了对数期生长速率。moaE ECtrunc株生长与WT和EC株相似。完整MPT合酶对H2O2耐受重要，moaD（DK）或moaE（EK）敲除株对H2O2抗性下降。值得注意的是，互补株（DC、EC或ECtrunc）未能恢复H2O2抗性，可能是由于Moco生物合成中MoaD与MoaE协调失调。MoaE C端截短较MoaE降低了对H2O2的敏感性。与WT相比，MPT合酶敲除后生物膜形成增加，在moaD（DC）和moaE（EC）互补株中观察到持续但较弱的效果。ECtrunc株生物膜形成与EK株相似。在几乎检测不到钼酸盐的M9培养基中观察到与LB培养基一致的生长表型。细胞内钼含量被用作钼代谢改变的间接指标，moaD或moaE敲除后较WT细胞内钼含量降低，moaD或moaE互补恢复了钼含量，而moaE C端截短未能恢复。
研究人员进一步研究了金属离子补充对细菌生长的影响。DC、EC、ECtrunc互补株和WT在不同金属离子浓度下显示相似生长模式，而ECtrunc株CFU高于EC株。最显著的是，添加Fe2+或Fe3+可部分挽救moaD（DK）和moaE（EK）敲除株的生长，而Zn2+、Mg2+和Ni2+对moaE（EK）敲除株效果较温和。扫描电镜（SEM）图像显示moaD或moaE敲除后形态异常，细胞间黏附减少、体积增大，宽度显著大于WT、moaD或moaE互补株。ECtrunc株宽度略大，但变化小于敲除株。
2.2 MPT合酶参与元素代谢与金属离子稳态，介导细菌致病性
对moaD或moaE敲除株与野生型及互补株进行比较的RNAseq用于揭示MPT合酶的互作网络。金属转运因MPT敲除而受到破坏，moaD或moaE敲除后modA、merR和cueR上调，而nikR（13835）下调并经qRT-PCR进一步确认。为准确评估，分别对moaD和moaE进行DEGs交集分析。WT或互补株如同正常常驻菌群，构建细胞包膜并相互通讯，以下基因表达增加：metF（编码甲硫氨酸生物合成的一步）、细胞包膜生物合成中的糖基转移酶、T1SS的Tol生物聚合物转运系统中的tolB或15620（tolQ）、信号转导相关氮调控蛋白NR(I)、芳香代谢通路的benA和paaC，以及涉及金属离子转运和ROS耐受的katE，均经qRT-PCR验证。moaE敲除较moaD表现出更广泛的影响，分别有41个对16个DEGs，检测到超过2.5倍数量的下调DEGs，包括与包膜生物合成相关的06835（wzb）、06840（wza）和08815（lgt），以及用于信号转导的含GGDEF结构域蛋白。还有与渗透应激相关的betI和betB（经qRT-PCR验证）以及用于铁稳态的barB和basG。另一方面，moaE或moaD敲除后细胞处于耗竭和毒性状态，分别有111或69个DEGs表达增加，包括参与聚-β-(1,6)-N-乙酰葡糖胺合成与输出的生物膜形成相关PEGA结构域蛋白、包括氨基酸通透酶、硫酸盐ABC转运蛋白和MFS转运蛋白在内的转运蛋白、含00550（GIY-YIG）或00670（VRR-NUC）结构域用于物理接触抑制的核酸酶及其辅助tssM或含PAAR结构域的T6SS蛋白。还有moaE突变株特异的上调DEGs，如与氮和锌稳态相关的组氨酸利用hut操纵子基因hutH、hutU，以及moaD缺失株中的ahpF氢过氧化物还原酶。
MoaE C端聚组氨酸尾截短也进行了RNAseq，DEGs通过ECtrunc与EK或EC互补株比较产生。组氨酸尾截短后变化相对轻微，检测到22个上调和38个下调DEGs。按基因位点聚类，芳香族分解代谢（包括苯丙氨酸降解）和铁稳态是主要受影响通路，如芳香环羟基化双加氧酶和苯丙氨酸代谢通路的miaA，以及负责铁同化的铁稳态ent、bas和bau基因，均经qRT-PCR进一步验证。
为确认MPT合酶参与金属稳态，统计了与不同金属相关的DEGs数量。与野生型相比，基因敲除株中鉴定到最多与金属离子相关的DEGs。除其他金属外，镁、锌和铁相关DEGs数量在moaE与moaD之间显示显著变化，而通过C端富组氨酸截短，镁和铁相关DEGs数量发生变化，ICP-MS在不同菌株中检测到一致的金属含量变化，moaE敲除株较野生型在镁、锌和铁方面变化最大，与moaE互补株相比，C端富组氨酸尾截短后镁和铁显示显著变化。
2.3 MPT合酶结构呈现内在无序的C端尾
使用pET28a分别过表达，MoaD以单体形式洗脱，而MoaE在尺寸排阻色谱上以二聚体形式洗脱。ITC实验显示MoaD与MoaE的相互作用比例为2:2，解离常数约为939 nM，亲和力比大肠杆菌中无活性MPT合酶高近18倍。鲍曼不动杆菌MPT合酶的晶体结构在2.0 ?下解析，结构模型包括MoaD的3–84位残基（全长1–84）和MoaE的1–143位残基（全长1–161）。MPT合酶显示预期的中心MoaE二聚体，两侧各有一个MoaD亚基，其羧基端二甘氨酸基序策略性地插入相邻MoaE亚基，在此可能贡献硫原子以在钼结合位点形成二硫烯基团。活性位点位于MoaE二聚体与MoaD C端交界处，被保守的Lys、Arg和His残基包围。鲍曼不动杆菌MPT合酶结构可见结合来自结晶液的7个硫酸根离子。
MoaE通过中心六链β-折叠二聚化，MoaE间界面由反平行β1和β1*链形成。每个MoaD与一个MoaE相互作用，两个（MoaE-MoaD）异二聚体在结构上相同。界面氨基酸主要来自MoaD的C端（包括经典二甘氨酸）和MoaE靠近非经典聚组氨酸尾的羧基端。Dali搜索生成MoaD和MoaE的最相似6个结构，MoaDs或MoaEs的序列比对分别显示20.4%和30.2%的相似性，MoaDs的结构叠合和MoaEs的比对表明所有亚基间界面保守。
2.4 MoaE富组氨酸羧基端无序，且对蛋白稳定性尤其金属离子结合时必需
SAXS实验生成的Kratky图表明MoaE的C端富组氨酸尾内在无序，其在X射线晶体结构中不可见以及AlphaFold 3生成的20个不同模型的柔性进一步佐证了这一点。通过将MoaE柔性富组氨酸羧基端建模到已解析的MPT合酶复合物结构，SAXS数据的卡方拟合从50显著降至1.4。
鉴于富组氨酸C端尾的潜在金属离子结合能力，研究人员进行了MoaE与金属离子的ITC相互作用实验，表明Ni2+、Cu2+和Zn2+可结合MoaE，亲和力分别为5.2、3.4和240 μM，而与Fe2+、Fe3+、Mg2+、Mn2+、Cr3+或Ca2+未检测到可见相互作用。MoaE羧基端截短消除了与Ni2+、Cu2+和Zn2+的相互作用。
在热位移实验中，羧基端截短不影响MoaE二聚体的Tm，但调节其对Zn2+、Ni2+和Cu2+的敏感性。5或20 μM Zn2+或Ni2+降低Tm，而80 μM Zn2+升高Tm，MoaE二聚体的变化幅度比C端截短MoaE更显著。对于MPT合酶，MoaE羧基端截短使其Tm升高，但Zn2+和Cu2+（Ni2+除外）使其降低。20或80 μM Zn2+降低MPT合酶的Tm，MoaE C端截短后变化幅度更强。而MoaE C端截短降低了80 μM Cu2+引起的MPT合酶Tm变化程度。巧合的是，在拟南芥中观察到铜结合到钼蝶呤二硫烯硫中间体。
2.5 MPT合酶在鲍曼不动杆菌ATCC 19606感染大蜡螟或小鼠时与毒力减弱相关
MPT合酶破坏引起的代谢缺陷可能对细菌毒力产生间接影响。进行了大蜡螟感染模型和环磷酰胺诱导中性粒细胞减少的小鼠肺炎模型，分别用于致死率和肺侵袭实验。大蜡螟幼虫在最后左前肢注射10 μL OD600为0.2的PBS新鲜细菌后记录生存曲线并观察五天，以不接种和PBS注射为阴性对照。moaD（DK）和moaE（EK）敲除株较WT、DC和EC互补株死亡更少。WT和EC互补株在五天内显示最高致死率，而ECtrunc致死率介于EK和EC之间，感染前两天后不再有死亡。
小鼠经鼻接种约5×10^7 CFU新鲜细菌50 μL一天后，采集肺、肾、肝、脾和血液用于细菌载量计数，肺、肾、肝和脾也采集用于组织病理学分析。在肺组织中，鲍曼不动杆菌感染引起炎性浸润，WT、DC或EC互补株较DK或EK缺陷株检测到炎性细胞数量增加和间质间隙显著肿胀，提示严重肺部炎症。ECtrunc互补株引起的炎症程度介于WT或EC互补株与EK缺陷株之间。用CD68抗体标记的巨噬细胞检测到一致现象。不同菌株侵袭与PBS接种在肾、肝和脾中未观察到差异。
37°C LB培养24 h后菌株差异较小，而moaD（DK）或moaE（EK）敲除株在肺和肾中较WT、DC或EC互补株细菌载量显著降低。EC互补株与野生型显示相似细菌载量，在所有菌株中于肺、肾和脾显示最高水平。C端截短MoaE（ECtrunc）互补后细菌载量在肾、脾和血液中显著少于EC互补株。在肝中，EK缺陷株和ECtrunc互补株细菌载量显著高于其他菌株。
3 讨论
为适应金属可利用性的变化，病原微生物发展出金属调控系统以克服宿主营养免疫，包括金属限制和金属中毒。鲍曼不动杆菌具有高镍生物吸附能力，以及不动杆菌中MoaE羧基端尾等富组氨酸区域。镍响应调控因子NikR（13835）被moaD或moaE敲除显著下调。某种程度上，镍补充有助于moaE突变体生长并补偿Moco生物合成的中断。高亲和力摄取系统的去阻遏是对金属限制的生理响应，modA在moaE或moaD突变导致Moco缺陷时上调，硫酸盐转运蛋白也可能作为一种非特异性、节能的替代钼酸盐获取系统发挥作用。
毫摩尔浓度的钼酸钠可在功能上挽救同源真菌钼插入酶缺陷。Moco生物合成对除钼之外其他金属离子代谢的影响，已通过MPT合酶不同突变株的金属含量变化以及金属相关基因数量得到验证。在植物中，钼掺入过程中铜可结合钼蝶呤二硫烯硫，锌已被鉴定为CNX1E的辅因子且对其催化活性必需，而镁为CNX1G活性所需。moaE敲除下调betI，后者是调控betIBA操纵子响应渗透应激的阻遏物，与盐的相互作用可消除其阻遏。鲍曼不动杆菌中的moaE可能作为镍储库和金属离子传感器以增加对金属中毒的抗性。尽管存在不完全互补的限制，MoaE C端组氨酸尾截短在额外金属离子刺激下增加了细菌生长，可能是通过减弱其诱导的代偿性应激机制。然而，截短降低了细胞内钼含量但在感染模型中致病性轻微。
铁通过多种方式与Moco生物合成紧密相连：Fe-S簇是许多Moco生物合成相关蛋白的组分，如MoaA；铁代谢调控因子FNR调控moaABCDE和moeAB操纵子；IscS为许多含Fe-S簇蛋白以及MPT合酶中Moco生物合成所需的硫转移所必需。许多含Moco酶也含有Fe-S或血红素辅因子。在本实验中，铁补充部分恢复了moaE或moaD敲除株的生长。研究人员推测许多蛋白中Fe-S簇的形成因IscS与分离的MoaD或MoaE的非生产性结合而受挫，这可通过铁补充部分缓解。某些含铁酶也可能替代含钼酶的部分功能以补偿Moco生物合成缺陷。需要进一步工作阐明补偿性铁补充的确切机制。
moaE缺失增加hut操纵子表达，HutH在高组氨酸浓度条件下紧密结合Zn2+，可作为不稳定His-Zn池，这合理说明了moaE敲除株在600 μM锌下轻度生长。此外，Mg2+离子和L-组氨酸关键调控hutP，即hut操纵子的抗终止调控因子。Mg2+是MoeB重新硫化MoaD以及将钼酸盐插入基于蝶呤的钼辅因子所必需的。MoaE敲除的生长减弱不如MoaD严重，添加锌、镁和镍在一定程度上恢复了鲍曼不动杆菌缺陷型moaE的生长，这可能是通过对代谢或应激反应的间接影响所致，有助于MoaE的金属依赖性调控。
moaD或moaE敲除导致对ROS敏感性显著增加，与负责解毒过氧化氢的katE下调一致。MoaE富组氨酸尾截短较完整MoaE增加了对过氧化氢的抗性。金属离子也可能参与其中，Cu2+/Ni2+结合基序称为ATCUN基序，由第3位组氨酸残基组成（XXH，X代表任意残基），而Zn2+结合基序为HEXXH（X代表任意残基）。ATCUN基序采用平面正方形几何构型，金属离子结合后在抗坏血酸或单过氧邻苯二甲酸镁存在下已被证明可诱导活性氧（ROS）产生。需要进一步工作确定MoaE富组氨酸标签协调的金属离子是否能催化ROS产生。
MoaE羧基端可能赋予最佳结构构型以使肽与其他分子相互作用。在结核分枝杆菌中，MoaE可塑性C端区域改变其与MoaD伴侣的相互作用、结构重排及MPT合酶功能。产气克雷伯菌UreE中的富组氨酸羧基端负责镍结合但对脲酶活性非必需。有趣的是，鲍曼不动杆菌无活性MPT合酶中MoaD与MoaE的结合亲和力（939 nM）与大肠杆菌活性状态中MoaD-SH与MoaE（2.6 ± 0.9 μM）处于相似水平。由于已发现两个亚基的结合亲和力与MPT活性相关，鲍曼不动杆菌中的MPT合酶可能更具活性。需要更多工作探索MoaE内在无序富组氨酸羧基端尾的确切功能。
4 材料与方法
4.1 序列相似性网络分析
以MoaD或MoaE序列为查询，对NCBI非冗余蛋白序列（nr）和宏基因组蛋白（env_nr）数据库进行PSI-BLAST搜索直至收敛。MoaD和MoaE分别检索到713和1400条蛋白序列，随后手动整理属于不动杆菌的同源物（MoaD 686条、MoaE 1000条）。使用酶功能计划-酶相似性工具计算所有蛋白序列对的相似性，一致性至少40%。构建MoaD或MoaE的28或401个节点、318或79798条边、100%边一致性序列相似性网络，并探索Cytoscape（v3.9.1）的有机布局进行可视化。
4.2 MoaE C端组氨酸进化分析
通过序列相似性和PF02391/IPR003448结构域注释鉴定同源物，每个物种一条序列，以鲍曼不动杆菌ATCC 19606 MoaE（WP_000657202.1）为参考。保留天然C端延伸，排除注释为部分或片段、缺乏完整MoaE核心、超过20%明显截短、X富集超过1%或X超过三个、支持人工标签以及分配为MoeA、MoaD、MogA、ModA、MoaB、MoaC、MobA、MobB、ThiS和ThiF的蛋白。使用NCBI Taxonomy解析分类，基于参考状态、基因组完整性、注释质量、核心覆盖度和登录号顺序采用固定层级每个物种保留一条序列。对每个选定蛋白，直接提取原始未比对序列的最后18个残基，计算H_count及-18至-1位残基频率。属级汇总限于至少30个物种代表的属，并包括均值H_count的10,000次重复百分位自举区间。使用Mann–Whitney U检验和Cliff's δ比较不动杆菌与其余细菌物种代表。频率logo基于氨基酸频率使用Shannon熵和有限样本校正。
4.3 鲍曼不动杆菌基因敲除与互补株构建
moaD或moaE敲除株按先前描述构建。从ATCC 19606基因组DNA扩增moaD或moaE上下游500 bp，通过无缝克隆与pKD4质粒卡那霉素盒经同源片段重组连接入pET28a载体。DNA测序确认后，将moaD或moaE "上游-卡那霉素盒-下游"片段PCR产物经电穿孔法转化入表达RECAB的pAT04的ATCC 19606，替换原始moaD或moaE位点。使用ID引物获取序列并验证敲除株。互补株通过pAT04载体与moaD、moaE或C端截短MoaE（ECtrunc）重组经IPTG诱导构建，ECtrunc通过将moaE的D143（GAT）突变为终止密码子（TGA）生成。
4.4 扫描电镜细菌观察
各菌株37°C LB振荡过夜培养，稀释至OD600 0.1，转入12孔板，每孔1 mL浸泡无菌载玻片，37°C静置培养24 h。载玻片上细菌先经4%多聚甲醛室温固定20 min，再经2.5%戊二醛4°C过夜固定。磷酸缓冲液洗涤四次，每次15 min。经30%、50%、70%、80%至90%递增梯度乙醇脱水，每步15 min。最后100%乙醇脱水三次，每次30 min。溅射镀金后在MAIA3LMH（TESCAN，捷克）下观察。使用Image J从细菌图像计算宽度，在GraphPad中进行统计分析，三次独立生物学重复。
4.5 重组MoaD、MoaE及C端截短MoaE（ECtrunc）的克隆、表达与纯化
蛋白纯化时，从ATCC 19606基因组DNA扩增后使用2x MultiF无缝组装混合物（ABclonal）通过同源重组构建pET28a-AbMoaD重组载体。moaE片段扩增后经NcoI和EcoRI双酶切构建pET28a-MoaE。C端截短突变体MoaE（ECtrunc）通过将moaE的D143（GAT）突变为终止密码子（TGA）进一步生成。在大肠杆菌BL21(DE3)中，OD600 0.6～0.8、37°C时以0.5 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，同时转至18°C培养约16 h。4°C 6000×g离心10 min收集细胞沉淀，用Buffer A（20 mM Tris、150 mM NaCl、5%甘油，pH 8.0）重悬，超声破碎。去除细胞碎片后，裂解液上Ni-NTA琼脂糖柱（Qiagen）并用Buffer A平衡，用含25 mM咪唑的Buffer A洗涤，再用Buffer B（20 mM Tris、150 mM NaCl、5%甘油、500 mM咪唑，pH 8.0）洗脱。使用Superdex 75pg、Hiload 16/60（GE Healthcare Life Sciences）尺寸排阻色谱柱以Buffer A平衡进一步纯化。蛋白纯化于4°C进行。
4.6 H2O2耐受实验
H2O2抗性通过纸片扩散法进行，细菌37°C、220 rpm LB过夜培养，稀释至OD600 0.2，取200 μL与融化冷却的LB琼脂混合（含2 mM IPTG和适当抗生素）。用50 mL LB琼脂制作三个培养皿，中央放置含10 μL 0.22 M H2O2的固定大小无菌圆形滤纸。37°C过夜培养后测量抑菌圈直径。GraphPad Prism分析三次生物学重复数据。
4.7 生物膜形成实验
生物膜生物量通过结晶紫染色检测（经修改）。细菌37°C、220 rpm LB过夜培养，稀释至OD600 = 0.1，取200 μL接种于含2 mM IPTG和适当抗生素的96孔板，37°C再培养24 h。转移150 μL细菌至新96孔板测OD600。PBS轻洗板三次，1%结晶紫染色15 min。PBS洗板三次，95%乙醇溶解后测OD570。每菌株接种三孔，进行三次独立生物学重复。
4.8 金属离子对细菌生长的影响
制备1 L LB琼脂培养基并均匀混合，分装每锥形瓶100 mL，各瓶加入80 μM、180 μM或600 μM金属离子（由不同金属离子1 M储液稀释，pH无显著变化）。高压灭菌后，加入2 mM IPTG和适当抗生素倒板。LB过夜培养细菌稀释至OD600 = 0.1，取10 μL点接种于平板。37°C过夜培养后计数。三次独立生物学重复，数据在GraphPad Prism分析。
4.9 RNA测序与分析
WT、DK、DC、EK、EC或ECtrunc菌株从单菌落培养至OD600 = 0.6。收集细菌后，用TRIzol试剂/RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA，用Agilent 2100/2200生物分析仪（Agilent Technologies）、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific）和1%琼脂糖凝胶评估总RNA数量和质量。按厂商说明用rRNA去除试剂盒处理后，取1 μg总RNA构建下一代cDNA文库。文库上Illumina HiSeq时每个样本产生超过1450万reads的高测序深度。Cutadapt（v1.9.1）过滤原始reads以去除接头和低质量碱基，然后通过bowtie2（v2.2.6）比对到ATCC 19606染色体完整基因组（登录号CP046654）。通过DEGSeq（v1.38.0）计算显著差异表达基因，基于两个标准：∣log2 fold change∣> 1和校正p值（p-adj）< 0.05。基因表达模式热图按Z-score归一化基因计数进行层次聚类。KEGG通路分析以DEGs ≥ 2的数量按rich factor分布展示。
4.10 定量RT-PCR
从单菌落培养至OD600 = 0.6的WT、EK、EC、ECtrunc、DK和DC细菌被收集。使用RNAprep Pure总RNA试剂盒（离心柱法，Cat. No. DP430，TIANGEN，北京，中国）分离总RNA，过程中通过DNase I消化去除基因组DNA。NanoDrop分光光度计测定RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。取1 μg总RNA用HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR（Cat. No. R433-01 Vazyme，南京，中国）合成第一链cDNA。使用SupRealQ Ultra Hunter SYBP qPCR Master Mix (U+)（Cat. No. Q713-02，Vazyme，南京，中国）在20 μL总反应体积中进行qRT-PCR。在Bio-Rad CFX96 C1000 Touch热循环仪上按以下条件热循环：95°C初始变性3 min；40个循环95°C 10 s、57°C 30 s。扩增后进行熔解曲线分析（65°C至95°C，每步0.5°C递增）确认引物特异性。每次运行包含无模板对照（NTC）。使用看家基因16srRNA归一化。进行三次独立生物学重复，每次三个技术重复。相对基因表达通过2^-ΔΔCt法计算。基于ΔCt使用GraphPad Prism进行统计分析。
4.11 ICP-MS检测细胞内金属水平
菌株培养至OD600 = 0.6收获用于金属离子测定，高压灭活，60°C干燥过滤后记录重量。使用Touchwin2.0在PTFE管中硝酸消化，在PET塑料瓶中用超纯水稀释，通过ICP-MS（PE NexION 300D）检测金属水平。
4.12 MoaD与MoaE结合的等温滴定量热（ITC）分析
纯化重组MoaD和MoaE分别稀释至200 μM和20 μM。储液Buffer A来自MoaD和MoaE蛋白纯化期间的尺寸排阻色谱。使用MicroCal PEAQ-ITC（Malvern）按说明在25°C进行ITC实验。100 μL MoaD滴定入样品池中300 μL MoaE。三次独立生物学重复后用MicroCal PEAQ-ITC分析软件（Malvern）分析数据。金属离子相互作用实验中所有蛋白带或不带His标签表达，尺寸排阻色谱纯化前用1 mM EDTA螯合，MoaE通过其富组氨酸羧基端经Ni-NTA纯化，而MoaE Ctrunc通过离子交换色谱纯化。金属离子制备为200 μM，蛋白稀释至20 μM。
4.13 MoaE或MPT合酶响应金属离子的热位移实验
20 μM纯化重组MoaE、MPT合酶（MoaDE2）或C端截短MoaE蛋白与5、20或80 μM的ZnCl2、NiSO4或CuCl2于4°C孵育约30 min。然后与蛋白热位移染料试剂盒（Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems）的染料混合，在Bio-Rad CFX96 C1000 Touch热循环仪上以0.1°C步长从25°C升至98°C检测荧光强度。三次独立生物学重复，数据在GraphPad Prism（La Jolla，CA，USA）分析。
4.14 结晶、数据收集处理与结构解析
20°C下通过商用稀疏矩阵筛选试剂盒（Molecular Dimensions和Hampton Research）384孔板坐滴气相扩散法进行初始结晶筛选。0.5 μL蛋白溶液与等体积池液混合，对45 μL池液平衡。MoaD和MoaE纯化后，MoaE与过量摩尔数MoaD混合。MPT合酶结晶浓度为40 mg/mL，晶体在CSI+II G8中发现，含0.1 M氯化钠、0.1 M HEPES pH 7.5和1.6 M硫酸铵。数据集在上海同步辐射设施18U1和19U1线站收集，XDS处理和缩放X射线衍射数据。通过Phaser程序套件以6jbz为搜索模型（MoaD和MoaE分别共享22%或35%一致性）进行最大似然分子置换确定MPT合酶结构。通过PHENIX和COOT手动重建和精修模型。最终MPT合酶晶体结构在1.97 ?、空间群P41212、晶胞参数a = 109.4 ?、b = 109.4 ?、c = 121.4 ?、α = 90.0°、β = 90.0°、γ = 90.0°下解析，精修至最终Rwork/Rfree为0.1930/0.2210。使用Schr?dinger的Pymol 2.5程序生成所有结构图。蛋白界面通过PDBePISA生成。
4.15 小角X射线散射（SAXS）
MPT合酶从尺寸排阻色谱新鲜纯化，浓度为5 mg/mL。SAXS数据在上海同步辐射设施BL19U2线站以批次模式293 K收集，动量转移范围0.04至0.45 ??1。每个样品收集20帧，未检测到辐射损伤。数据通过ATSAS 3.0解读，PRIMUS进行缓冲液扣除，通过距离分布实验获得P(r)，或通过Porod体积或分子量实验及MoW2服务器测定分子量。晶体结构与SAXS实验数据的比较在DAMMIF和CORAL网络服务上进行，添加MoaE缺失的羧基富组氨酸末端。
4.16 鲍曼不动杆菌大蜡螟感染模型
大蜡螟感染实验按先前报道进行，选用长2–3 cm、重250–350 mg的大蜡螟幼虫，注射前禁食24 h。过夜培养后细菌用无菌PBS稀释至OD600 = 0.2，取10 μL注射入幼虫最后左前肢，以不接种和PBS注射为阴性对照。每组十条幼虫置于一个方形培养皿中37°C常规饲养，每天检查活动直至注射后五天。使用GraphPad Prism生成生存曲线。
4.17 鲍曼不动杆菌小鼠急性肺炎模型
六周龄C57BL/6JNifdc雄性小鼠在相同条件下饲养一周适应后进一步实验。为诱导中性粒细胞缺乏，接种前第4天和第1天两次用150 mg/kg环磷酰胺预处理小鼠。鲍曼不动杆菌菌株37°C过夜培养后生理盐水洗涤三次并稀释至适当光密度，不同组体重匹配，每只小鼠异氟烷麻醉后经鼻接种约5×10^7 CFU细菌于50 μL生理盐水中。接种一天后每组三只感染小鼠人道处死，采集血液、肺、脾、肝和肾用于进一步定量细菌学或组织病理学实验。血液样品及肺、脾、肝和肾用500 μL无菌生理盐水经匀浆器（MiNiBeadbeater-16，BioSpec Products Inc. USA）匀浆，10倍稀释后取10 μL接种LB琼脂平板过夜培养计数。肺、脾、肝和肾样品采集后立即4%多聚甲醛固定，标准石蜡包埋制备蜡块。苏木精-伊红（HE）染色的组织切片用全自动数字切片扫描仪（Pannoramic DESK，3DHISTECH，匈牙利）观察进行组织病理学实验。肺组织病理损伤评分以盲法按先前报道进行，每只小鼠评估8–10个随机高倍视野，五个参数包括间质炎性浸润、肺泡渗出、肺水肿、肺泡出血和肺泡结构损伤各评分0至4（0 = 无损伤；1 = <25%损伤；2 = 25–50%损伤；3 = 50–75%损伤；4 = >75%损伤）。各项评分之和代表每视野总组织病理评分，所有视野平均值作为每只小鼠最终评分。
作者贡献：YW和MJ设计并实施项目，MJ、WH、ZO、RW、JZ、XL、YJ、QY、XH和QQ在YW指导下开展实验。LG、FZ、PH参与数据分析。YW和MJ撰写论文，所有作者均有贡献。
致谢：感谢上海同步辐射设施国家蛋白质科学中心（NCPSS）BL18U1/BL19U1线站工作人员在数据收集期间的技术支持。本工作由国家自然科学基金（NO. 32570040、NO. 32500155、NO. 82502732、NO. 82102402、NO. 32170187）、陕西省自然科学基金（No. 2023-JC-JQ-63、2024JC-YBMS-662）和西安交通大学第一附属医院机构基金资助。
利益冲突：作者声明无利益冲突。
伦理声明：所有适用的机构和国家动物护理与使用指南均已遵守，所有动物实验经西安交通大学动物实验伦理委员会批准（NO. XJTUAE2025-71）。
数据可用性声明：支持本研究结果的数据可应通讯作者要求提供。由于隐私或伦理限制，数据不公开。登录号：MoaDE复合物与SO4^2?和Mg2+的结构因子和坐标已存入蛋白质数据库，登录号9XGP。
研究结论：鲍曼不动杆菌中的钼蝶呤合酶在细菌生长、形态决定、ROS耐受、生物膜形成及金属离子稳态互作中发挥重要作用；MoaE的富组氨酸C端尾内在无序，具有金属螯合能力并调节蛋白稳定性；MPT合酶与毒力相关，是抗菌药物研发的潜在靶点。
