《Advanced Science》：Injectable Peptide-Based Functional Amyloid Hydrogels as Tunable Depots for Sustained Drug Delivery
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治疗性蛋白的持续递送仍面临重大挑战，因为快速降解与扩散迫使研究人员频繁给药，从而损害疗效。在此，研究人员提出了一种可注射的肽基功能淀粉样水凝胶，作为一种多功能的药物储库（drug depot），可在实现治疗货物持续释放的同时保持蛋白质稳定性。作为代表性的治疗应
治疗性蛋白的持续递送仍面临重大挑战，因为快速降解与扩散迫使研究人员频繁给药，从而损害疗效。在此，研究人员提出了一种可注射的肽基功能淀粉样水凝胶，作为一种多功能的药物储库（drug depot），可在实现治疗货物持续释放的同时保持蛋白质稳定性。作为代表性的治疗应用，采用胰岛素递送用于糖尿病以验证该平台。该体系表现出优异的生物相容性与可注射性，可在90小时内实现可控的胰岛素释放，同时维持其结构稳定性。在糖尿病大鼠中单次皮下（subcutaneous）给药后，其在30分钟内恢复正常血糖并维持60小时，随后于66小时出现反弹，其血糖维持时间远长于游离胰岛素。长期体内生物安全研究证实，重复给药后无系统性毒性。为证明该平台的可调性，研究人员进一步采用海藻酸钠（sodium alginate）作为代表性生物添加剂对其进行工程化，从而实现了可调的释放动力学并延长了持续胰岛素释放时间，同时保持了可注射性与生物相容性。总之，这些发现确立了肽基功能淀粉样水凝胶——无论是否经生物添加剂工程化——均可作为安全、可注射且可调的持续治疗递送平台，而糖尿病则作为其用于广泛生物医学应用的概念验证（proof of concept）。
治疗性蛋白与肽类药物的临床应用长期受限于其在体内的快速扩散、结构失稳、酶降解及短半衰期，导致患者需频繁给药，严重损害治疗依从性并增加医疗负担。糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）作为一种全球性慢性疾病，目前患病人数已逾5.4亿，预计2045年将达7.83亿，外源胰岛素注射虽为其治疗基石，但反复注射伴随注射部位炎症、组织损伤、脂肪堆积、血糖波动及低血糖风险。尽管水凝胶作为可注射药物储库（drug depot）被广泛研究，但现有系统仍普遍存在爆发释放、长期生物安全性不明、批间差异及制备复杂等问题。功能淀粉样（Functional Amyloid）是由交叉β片层结构组成的超分子组装体，具有卓越机械强度与抗逆性，且近期研究证实天然来源淀粉样具备良好生物相容性。然而，肽基功能淀粉样水凝胶作为模块化、可持续治疗递送平台的潜力此前尚未被系统探索。基于上述科学问题，研究人员在本研究中旨在构建一种兼具治疗蛋白稳定与长效释放功能的可注射储库，并以胰岛素与1型糖尿病为模型验证该平台，相关成果发表于《Advanced Science》。
研究人员采用pH响应自组装法合成Fmoc-KLMEI（FA1）与Fmoc-KLLDI（FA2）两种功能淀粉样肽，借助透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）、原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）、冷冻扫描电子显微镜（Cryo-Scanning Electron Microscopy, Cryo-SEM）及流变学表征其纳米网络与粘弹性；通过傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared, FTIR）、硫黄素T（Thioflavin T, ThT）荧光及刚果红（Congo Red, CR）结合实验验证交叉β片层结构。研究利用包封效率（Encapsulation Efficiency, EE）测定、体外释放实验及荧光漂白恢复技术（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）评估胰岛素负载与扩散行为；采用离子对高效液相色谱（Ion-Pair High-Performance Liquid Chromatography, IP-HPLC）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）及圆二色谱（Circular Dichroism, CD）分析胰岛素完整性。体内研究在链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）诱导的雄性Wistar大鼠（样本队列来源：印度国家生物科学研究所）中开展；通过ThT动力学、CD及透射电镜评估原纤维对胰淀素（Islet Amyloid Polypeptide, IAPP）和α-突触核蛋白（α-Synuclein, α-Syn）的异源交叉播种风险。
2.1 肽基淀粉样水凝胶的制备与生物物理表征
研究人员通过pH依赖法成功制备FA1与FA2水凝胶。TEM、SEM及AFM显示水凝胶由高度有序、长而少分支的纳米原纤维构成，呈现连通多孔结构；流变学分析证实其粘弹性（储能模量G′大于损耗模量G″）及剪切变稀与触变性自愈合行为。FTIR在酰胺I带呈现典型交叉β片层信号，ThT荧光在480 nm处增强及CR结合后的特征红移进一步确证其淀粉样属性。
2.2 水凝胶溶胀、生物相容性及胰岛素负载功能表征
溶胀实验显示两种水凝胶在24小时内溶胀率仅约10%，体积变化极小。MTT法与溶血实验表明其对NIH 3T3成纤维细胞存活率大于90%且溶血率约2%，具有优异生物相容性与血液相容性。FITC-胰岛素包封效率在浓度5 mg/mL下达95%以上。体外释放实验表明两种水凝胶可持续释放胰岛素长达72小时，累积释放曲线符合零级动力学模型；FRAP实验显示约80%可移动分数、较短恢复半衰期及较高扩散系数，证实胰岛素可在原纤维网络内有效扩散并实现持续释放。
2.3 储存与释放期间包封胰岛素稳定性
在4°C储存6个月后，IP-HPLC、MALDI-TOF MS及非还原Tris-Tricine SDS-PAGE证实释放胰岛素无降解产物且保留一级结构；远紫外CD光谱显示其α螺旋二级结构（约208 nm与222 nm双负最小值）完好；STZ诱导糖尿病大鼠体内实验证实其降糖生物学活性与新鲜胰岛素相当。在37°C持续释放3天期间，多种生物物理分析同样证实胰岛素化学与结构完整性及体内功能保持。
2.4 1型糖尿病大鼠中体内降血糖作用
在STZ诱导的雄性Wistar大鼠模型中，单次皮下注射FA1负载胰岛素后，血糖于30分钟内恢复正常并持续维持约60小时（2.5天），显著优于游离胰岛素（6小时）及临床长效胰岛素类似物胰岛素甘精胰岛素（约18小时）。腹腔葡萄糖耐量试验（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, IPGTT）显示其具备良好葡萄糖清除能力。每2.5天重复给药持续15天，未出现低血糖风险，验证了长期持续血糖控制能力。
2.5 交叉播种评估与长期生物安全评估
ThT动力学、远紫外CD及TEM证实FA1淀粉样原纤维不加速IAPP与α-Syn的异源交叉播种，排除其诱发相关蛋白病理性聚集的风险。长期体内研究显示，六次重复给药后大鼠体重增长趋势正常；六器官Hematoxylin and Eosin（H/E）及Masson's Trichrome（MT）染色未见组织损伤或异常胶原沉积；血清天冬氨酸转氨酶（Aspartate Aminotransferase, AST）与血尿素氮（Blood Urea Nitrogen, BUN）水平正常，表明无系统性毒性。局部组织仅出现短暂、自限性炎症反应，通过免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）检测肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）与白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）显示第1天轻度升高，第5天即消退，无组织损伤或坏死。
2.6 掺入生物添加剂的功能性胰岛素释放调节
研究人员将0.3%、0.6%和0.9%海藻酸钠（Sodium Alginate, S.A.）掺入FA1制备复合水凝胶。结构表征显示其保留致密原纤维网络、多孔架构及交叉β片层特征，流变学证实粘弹性与剪切稀化行为；其中0.9% S.A.组网络重建受损，而0.3%与0.6%组保持快速触变恢复。体外释放实验表明0.3%与0.6% S.A.分别延长胰岛素释放至约78小时与90小时，且符合零级动力学；0.9%组因网络限制导致释放显著降低并转向Higuchi扩散机制。FRAP分析显示S.A.浓度增加限制胰岛素移动性，0.6%制剂在分子移动性与持续释放间达最佳平衡。在37°C释放4天后，IP-HPLC、MALDI-TOF MS及远紫外CD证实胰岛素保留化学完整性与天然二级结构，体内降糖活性与新鲜胰岛素相当。
在讨论部分，研究人员指出功能淀粉样水凝胶超越了传统被动储库的角色，其原纤维网络能够主动稳定治疗蛋白，在长期储存（4°C，6个月）与生理释放（37°C，3至4天）期间同时保全货物的化学完整性、一级结构与二级构象及生物学活性。该平台以单次注射实现了长达2.5天的正常血糖控制，显著减少注射频率并降低局部组织创伤风险。尽管当前系统不具备葡萄糖响应性闭环控制能力，但生物添加剂策略证明其释放动力学具有可调性与可扩展性。安全性方面，研究证实其无系统性器官毒性、无疾病相关淀粉样蛋白交叉播种活性，局部炎症反应呈自限性消退。综合而言，肽基功能淀粉样水凝胶作为一种不含动物成分、无需化学交联剂、生物可降解且合成简便的平台，为下一代治疗蛋白与多肽类药物的持续递送提供了安全、可调、可注射的新策略。
