《Advanced Synthesis & Catalysis》：Multienzyme Cascade Reactions: Compatibility, Cooperativity, and Control
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多酶级联反应（multienzyme cascades）将多个生物催化反应（biocatalytic reactions）整合于单一合成操作中，无需分离中间产物（intermediates）。与传统多步序列（multistep sequences）相比，其在时
多酶级联反应（multienzyme cascades）将多个生物催化反应（biocatalytic reactions）整合于单一合成操作中，无需分离中间产物（intermediates）。与传统多步序列（multistep sequences）相比，其在时间和资源效率方面具有显著优势，且常常能够实现各组成步骤独立进行时不可能实现的总体转化。在本综述文章中，研究人员重点介绍近期文献（主要为2020–2025年）中的代表性多酶级联反应案例，并围绕三个核心主题讨论其主要优势与挑战：所需化学转化与生物催化剂（biocatalysts）的兼容性（compatibility）、同一反应器中同时运行的酶之间的协同性（cooperativity），以及对完整反应序列最终结果的控制（control）。充分考虑这些方面的级联设计已实现了多种重要目标化合物的快速高效合成，包括工业规模制备的复杂药物。
1 引言
级联反应（cascade reactions）广义上指在不分离中间产物的单一合成操作中组合多个转化的化学过程。在生物催化领域，其可表现为多米诺级联（domino cascades，酶步骤触发自发的后续反应）、化学-酶级联（chemoenzymatic cascades，结合化学催化剂与生物催化剂）和多酶级联（multienzyme cascades，多个生物催化转化串联）。后两类过程可以同步方式（所有催化剂和试剂一开始加入）或顺序方式（部分组分在前序步骤完成后加入）进行。此外，并非所有组分都必然直接接触，系统可以通过模块化（modularization）或区室化（compartmentalization）实现。所有类型的级联反应都受益于避免中间产物分离这一共同优势：减少所需的工作纯化和纯化步骤数量，节省时间和成本，降低能耗和物料投入，避免与有害中间产物的接触以及废物的产生。真正的催化剂协同作用只能通过实现各步骤直接相互作用的级联设计实现。同步级联系统的额外优势包括辅因子或辅底物的内部再生（如氢借级联（hydrogen-borrowing cascades））、后续转化对不利平衡的驱移，以及不稳定中间产物的逐步生成与即时消耗。然而，同步级联以更高的要求为代价：与顺序设置相比，对组成转化的兼容性要求更高。潜在的交叉反应性和组分间的其他有害相互作用必须在设计中加以考虑。当兼容性、协同性和控制三者良好协调时，所得的级联过程相比传统多步序列可实现显著的选择性和生产力的提升。
1.1 兼容性
任何多步级联过程成功的前提是其组成部分——试剂和催化剂——能够在一组共同的反应条件下进行所需的同步转化。酶天然适合级联设计，因为它们通常表现出高度的基础兼容性：它们在水性环境中进化而来，通常在温和的温度、压力、盐度和pH范围内工作；其活性中心通常埋藏于三维蛋白质结构内部（confinement），屏蔽与其他反应组分的有害相互作用；并且它们在底物的结合和转化方面表现出高度选择性，限制了无效副反应的风险。然而，酶的兼容性显然存在极限。只有在极少数情况下，多种酶才能在完全相同的反应条件下达到最大活性，且完全不受来自级联中较早或较晚步骤的底物、中间产物、辅因子等的影响。最简单的级联设计——所有组分在生物转化开始时一次性加入单一反应容器——通常会使所涉及的所有酶在性能最优点之外的条件下运行。如果简单反应设置的好处超过性能损失，这种折中方案可以接受；然而，如果反应最优点严重分歧，或与其他反应组分的相互作用引发不期望的副过程，则可能需要通过时间分离（如顺序添加试剂或酶）或空间分离（如区室化、模块化）来分离级联步骤。这种对级联的子结构化拓宽了操作窗口，减少了组成反应之间的有害"串扰"，同时保留了阶梯式序列相对于传统多步合成的最基本优势：减少工作纯化和纯化步骤的时间、能量和物料投入。但这同时也限制了酶转化之间产生性相互作用（即酶协同作用）的机会。
1.2 协同性
在最佳情况下，多酶级联中的多种酶协同工作，以实现各反应独立进行时不可能实现的结果。例如，可逆转化的不利平衡可以通过提供强热力学驱动力的下游步骤驱移至产物侧。多酶级联中生成手性产物时，酶之间的协同性将强烈影响总体立体化学结果。如果手性中心在序列早期生成并被携带过后续步骤，则所有下游酶对映选择性（enantioselectivity）共同贡献于最终产物的光学纯度。如果各个对映选择性匹配，则每次转化都会提升对映体过量（enantiomeric excess）。然而，这种选择性提升以产率为代价。若不增加产率而提升光学纯度是可能的，前提是两个或多个底物或中间体的立体异构体能够转化为同一产物的立体异构体。为此已开发出三种主要策略：（i）将消旋化（racemization）或差向异构化（epimerization）与动力学拆分（kinetic resolution）结合，形成动态动力学拆分（dynamic kinetic resolution, DKR）；（ii）通过前手性中间体的立体会聚（stereoconvergence）或立体反转（stereoinversion）；（iii）通过相反底物对映体的直接转化实现立体会聚，这要求一个对映体发生立体反转而另一个保持立体保留，这种立体化学行为在单一酶转化中极为罕见。某些环氧水解酶（epoxide hydrolases）——最著名的是来自马铃薯的St-EH1——被发现以这种方式运作，能够将外消旋环氧化物转化为对映体纯的产物。
1.3 控制
多酶级联越复杂（就步骤数量和步骤间依赖性而言，如辅因子循环），对反应控制的挑战就越大。对于程序上最简单的系统——所有组分同时加入、所有组成反应在单一反应容器中同步进行——操作员可调整的"手段"有限，只能依赖所涉及酶的内在选择性来控制总体反应结果。为缓解操作员控制的缺乏，已经提出了通过外部刺激（如光、温度、磁场）原位调节酶活性的几种方法。然而，这些方法的潜力尚待证实。延迟添加试剂或酶是实现生物催化级联控制的一种简单而有效的选项。它将总体反应序列结构化为不同的时间分段，涉及比完全同步过程更复杂的反应混合物，因此不太容易产生不期望的副反应。区室化步骤的空间分离可以在需要实施分歧的反应条件或需要最小化反应组分间有害相互作用时改善级联性能。区室化的最简单形式是通过在不同微生物宿主中异源表达级联酶，利用细胞膜作为物理屏障。酶在合成聚合物或囊泡中的包封是区室化的更具技术复杂性的选择。使用固定化酶的流动体系（flow regime）的实施导致对生物催化级联的技术要求更高，但也实现了显著改善的过程控制。
2 代表性实例
多酶级联反应在近年已非常普及，任何全面综述都会过于冗长和复杂。因此，本文使用近期文献（主要为2020–2025年）中的选定实例来说明兼容性、协同性和控制如何是生物催化级联成功的核心。
2.1 时间和空间分离级联步骤以克服兼容性限制
通过延迟添加酶和试剂在时间和空间上分离步骤是解决多酶级联中不兼容性问题最常见的方法之一。一个最近的案例使用D-果糖-6-磷酸醛缩酶（D-fructose-6-phosphate aldolase, FSA）生成醛糖（如D-苏阿糖），然后由转酮醇酶（transketolase, TK）与羟基丙酮酸缩合生成酮糖。由于醛糖的(2S)-立体构型，所研究的醛糖是(2R)-选择性TK的差底物，需要升高反应温度至60 °C才能实现足够快的转化。在该温度下，羟基丙酮酸缓慢降解，因此作者使用耐热转氨酶（transaminase, TA）从L-丝氨酸原位生成。然而，用于醛合成的醛（乙醇醛和甲醛）同时被转酮醇酶和转氨酶良好接受，产生明显的交叉反应性。此外，所需的FSA-A129G变体不耐热。因此，该级联被分为两个阶段：首先在25 °C和pH 8.0下生成D-苏阿糖（98%转化率），随后稀释至50 mM并在60 °C和pH 7.0下继续转化，丙酮酸分两批各50 mM添加，获得D-塔格糖55%的分离收率。
另一个研究通过酶共表达的级联模块化和不兼容步骤的时间分离，实现了苯酚和三种邻位取代苯酚衍生物经酪氨酸和乙烯苯酚中间体转化为对-(氨基乙基)苯酚。热力学分析鉴定出TPL反应、醇氧化和最终转氨化为热力学不利或中性的步骤，需要不可逆下游转化的支持。作者决定添加丙酮酸去除反应（使用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）还原为乳酸盐），并将从苯酚到乙烯苯酚的三个转化和从乙烯苯酚到胺产物的转化组合为独立的整细胞生物催化剂，确保每个独立模块的热力学总体有利性。当两个模块同步运行时，LDH对丙酮酸的去除干扰TPL反应，导致有限的总体转化率（<36%）和大量未反应的苯酚残留；在第一阶段完全消耗苯酚后添加模块2的生物催化剂避免了这种有害交叉反应性，将转化提升至52%–72%。
在串联流动反应器中区室化生物催化级联是确保转化顺序和使原本不兼容的多酶序列可行的最有效选择之一。一项研究将来自镰刀菌的GOase变体M3–5在多点进样反应器（multipoint injection reactor, MPIR）中的醇氧化与固定床反应器中固定化的转氨酶或还原胺酶（reductive aminase, RedAm）催化的下游胺化步骤相结合。GOase与胺不兼容，因为胺会抑制酶活位点的反应性铜中心。这种方法不仅使这些原本不兼容的生物催化序列得以高转化率进行（10个报道实例中有10个转化率>90%），还实现了多个底物的在线筛选以及操作员对伯胺和仲胺产物的选择。
2.2 多酶协作提升立体化学纯度
生物催化级联通常在所涉及的酶表现出匹配的对映或非对映选择性时，沿反应序列受益于立体化学纯度的提升。一个近期开发的对映收敛转化将外消旋苯乙烯氧化物及其三个对位取代衍生物转化为相应的(R)-扁桃酸衍生物。在该体系中，来自马铃薯的环氧水解酶（epoxide hydrolase, St-EH）将外消旋环氧化物通过(S)-环氧化物的立体反转和其(R)-对映体的立体保留转化为非对射体醇，选择性不完全（91% ee）。随后使用来自天蓝色链霉菌的四重变体醛石糖醇氧化酶（alditol oxidase, Sc-Aldo(M)）将伯醇优先氧化为醛，将对映体过量提升至>99%。由于该氧化酶在醛到羧酸的最终氧化中活性较差，该步骤由来自大肠杆菌的苯乙醛脱氢酶（Ec-ALDH）支持，使用NADH氧化酶（NADH oxidase, NOX）进行辅因子再生，保持低浓度的反应性醛中间体。为克服兼容性问题（环氧化物使Aldo(M)失稳，NOX存在时Aldo(M)表达降低），作者将该级联区室化为两个整细胞模块，一个用于环氧化物水解，另一个用于两个氧化步骤。这种优化的双细胞设置实现了92%转化率和77%的分离收率。
非对映选择性提升在近期的2,3,6-三取代哌啶合成中被观察到。从二酮酯使用转氨酶和亚胺还原酶（imine reductase, IRED）的生物催化剂，工程TA变体（ArR-mut11）对亚末端羰基的选择性转氨产生具有优异对映选择性但广泛变化的非对映控制（ee >99%，dr 49:51–92:8）的环亚胺立体异构体。控制实验将这种效应追溯到TA催化的亚胺C3立体中心的差向异构化和两种酶的匹配立体选择性。级联组合产生了(2R,3S,6S)-24，转化率97%，非对映体比（diastereomeric ratio, dr）为97:3。
2.3 通过辅因子和辅底物的内部循环避免化学计量试剂投入
级联步骤不仅可以通过线性序列中的共同中间产物连接，还可以通过共享的辅因子或辅底物连接。当一种酶的副产物成为另一种酶的辅底物时，可以省略辅助再生反应，而是建立内部再利用（单周转）或循环（多周转）。氧化还原中性的醇到胺转化是生物催化中这一概念研究最广泛的应用之一。其中一个级联从相应的二酮醇实现对苯丙醇胺（phenylpropanolamine）所有四种立体异构体的不对称合成。该序列从Fus-SMO催化的环氧化开始，随后St-EH或Sp-EH催化的环氧化物水解得到二酮醇，然后ADH催化的区域选择性氧化和TA催化的胺化，其中L-丙氨酸脱氢酶（L-alanine dehydrogenase, AlaDH）作为连接酶，在消耗氨的同时再生NAD+和TA的辅底物丙氨酸。通过筛选三种ADH和六种转氨酶，作者能够为每种二酮醇异构体找到合适的酶组合，产物收率81%–96%，对映和非对映体控制优异（>99% ee，96:4至>99:1 dr）。
类似的醇到胺转化构成了五步级联的中心部分，该级联将甘油（glycerol）转化为多种非规范L-氨基酸（noncanonical L-amino acids）。该序列从工程醛石糖醇氧化酶（Tf-AldO）氧化甘油开始，需要过氧化氢酶（catalase）去除过氧化氢。接下来，D-甘油酸由D-甘油酸-3-激酶（Sc-G3K）磷酸化，使用多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase, PPK）进行原位ATP再生。所得磷酸化中间产物由Ec-PGDH氧化为酮，并由Ab-PSAT胺化。辅因子和辅底物循环由L-谷氨酸脱氢酶（L-glutamate dehydrogenase, GluDH）介导。最后，工程O-磷酸-L-丝氨酸硫解酶（As-OPSS）催化磷酸基团被各种硫、硒或氮亲核试剂取代。该生物催化级联在三个阶段顺序设置中，在甘油浓度30 mM下，22个制备规模反应以68%–99%的分离收率和95%–99% ee获得氨基酸产物。
2.4 不可逆后续反应驱移不利平衡
将热力学不利的转化与提供强驱动力的下游步骤耦合，可用于将总体反应平衡驱移至产物侧。这一策略最近被用于多种共享β-羟基-α-氨基酸作为中心中间产物的级联。这些化合物可以从醛作为aldol受体通过L-苏氨酸转醛醇酶（L-threonine transaldolase, LTTA）催化的反aldol化或与甘氨酸作为供体通过L-苏氨酸醛缩酶（L-threonine aldolase, LTA）催化的aldol加成生成。两种过程都是可逆的。LTD或PSDH催化的脱胺可提供必要的平衡驱移，但导致无手性的酮酸产物，因此需要另一个下游步骤来重新引入手性性。该概念首先由Liu及其同事实施，他们构建了共表达LTA、工程LTD变体、L-或D-选择性2-羟基异己酸脱氢酶（HicDHs）和甲酸脱氢酶（formate dehydrogenase, FHD）的E. coli菌株，从相应的醛和甘氨酸合成多种α-羟基酸（α-hydroxy acids），转化率55%–92%，ee 96%–99%。
2.5 设计良好的级联反应解决具有挑战性的工业合成问题
多酶级联反应已被研究数十年，但近年来，几种高度优化的级联已超越传统合成方法，实现工业化应用。其中之一是抗逆转录病毒药物islatravir的合成。这个九酶六步序列基于细菌核苷补救途径的逆转。第一步，2-乙炔甘油由固定化半乳糖氧化酶（Fg-GOase）末端氧化为相应的醛，实现(R)-选择性去对称化。剩余的伯醇基团由固定化泛酸激酶（pantothenate kinase, PanK）磷酸化，使用乙酸激酶（acetate kinase, AcK）和乙酰磷酸进行ATP再生。所得磷酸化中间体经历一系列三种可逆反应：DER催化的aldol加成，随后自发环闭，生成非天然戊糖磷酸衍生物，其磷酸基团由Ec-PPM从C5转移到C1。这激活中间产物以进行Ec-PNP催化的2-氟腺嘌呤对磷酸盐的亲核置换。这些转化的不利平衡通过以葡萄糖-1-磷酸形式"捕获"磷酸副产物而驱移至产物侧。冷却至5 °C时，islatravir从反应混合物中结晶，通过过滤以76%的收率分离。该级联还展示了本综述三个主题的实际相关性：通过顺序执行前两步实现控制，通过蔗糖磷酸化酶实现平衡驱移，通过稀释激酶步骤的产物溶液解决兼容性挑战，以及沿反应序列提升ee的立体化学协同性。
3 结论与展望
多酶级联反应继续是生物催化研究创新的热点领域。过去五年，每年有超过一百种新级联系统发表，趋势是复杂性增加：三步或更多步骤的序列变得普遍，辅因子或辅底物的内部循环也是如此。在单一宿主中共表达多种酶现经常用于模块化级联，多步流动生物催化正在获得发展。展望未来，治疗性寡核苷酸需求的增长使传统基于亚磷酰胺的DNA和RNA合成的局限性显而易见，生物催化方法正在作为替代被开发，其中一些依赖多酶级联进行寡糖的组装。另一个新兴发展领域是将人工多酶系统整合到中心代谢中。研究人员预计，本综述的三大主题——兼容性、协同性和控制——将继续为成功的生物催化级联反应开发提供有价值的、普遍性的指导。
