巴戟天寡糖通过增加肠道微生物多样性和丁酸水平并降低海马Pla2g4a表达缓解卒中后抑郁样行为

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Morinda Officinalis Oligosaccharides Alleviate Post-Stroke Depression-Like Behaviors Alongside Increased Gut Microbial Diversity and Butyrate Levels and Reduced Hippocampal Pla2g4a Expression

　　

摘要 背景与目的： 卒中后抑郁（post-stroke depression, PSD）是脑缺血后一种常见且致残的并发症，但目前仍缺乏基于机制的疗法。微生物群-肠-脑轴（microbiota-gut-brain axis, MGBA）被认为参与PSD病理生理过程，但精确的分子通路尚不清楚。巴戟天寡糖（Morinda officinalis oligosaccharides, MOO）是中国临床批准的抗抑郁药，口服吸收差，提示其可能存在肠道依赖性机制。 实验方法： 雄性C57BL/6J小鼠接受短暂大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, MCAO）后，再进行21天的慢性束缚应激（chronic restraint stress, CRS）以建立PSD模型。从第7天至第27天，通过灌胃给予MOO（50 mg/kg/天）。研究人员评估了抑郁样行为、基于16S rRNA的肠道菌群谱分析、短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFA）定量、肠道和血脑屏障完整性评估以及海马蛋白质组学。采用供体对照粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）设计评估了MOO相关粪便效应的可转移性。通过补充丁酸钠和AAV介导的海马Pla2g4a过表达进一步研究了丁酸盐-Pla2g4a的关系。 主要结果： MOO给药改变了肠道微生物组成，增加了益生菌丰度并减少了有害菌丰度，同时伴随粪便丁酸水平升高。供体对照FMT实验提供了初步证据，表明来自MOO处理PSD供体的可粪便转移因子可能有助于改善PSD受体的行为。MOO和丁酸钠处理与肠道和血脑屏障完整性指标的改善相关。海马蛋白质组学将Pla2g4a（一种与神经炎症相关的磷脂酶）鉴定为与观察效应相关的候选分子。MOO和丁酸钠处理均与海马Pla2g4a表达降低相关，且Pla2g4a表达与丁酸水平呈负相关。海马Pla2g4a过表达减弱了与丁酸钠处理相关的行为改善，支持Pla2g4a在丁酸钠反应中的功能参与。 结论与意义： MOO处理与PSD小鼠抑郁样行为的改善相关，并伴随肠道微生物改变、粪便丁酸增加、屏障完整性改善和海马Pla2g4a表达降低。FMT发现提供了初步证据，表明来自MOO处理供体的可粪便转移因子可能促进行为改善，而Pla2g4a过表达减弱了丁酸钠的行为效应。这些发现强调了MOO、肠道源性丁酸、屏障完整性和海马Pla2g4a在PSD中的潜在关联。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

卒中后抑郁（post-stroke depression, PSD）是脑缺血后最常见且严重的并发症之一，严重影响患者的功能康复和生活质量，但其临床治疗率仍然不理想。近年来，微生物群-肠-脑轴（microbiota-gut-brain axis, MGBA）理论的发展使肠道微生物在PSD发病与进展中的作用受到广泛关注。现有证据表明，脑卒中后的脑损伤可触发全身应激反应，改变自主神经张力并损害肠道屏障完整性，最终导致肠道微生物失调。这种失调通常表现为产短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFA）细菌如丁酸产生菌的减少，以及促炎微生物群的扩增。这种生态失衡通过多条环路机制加剧PSD病理：包括神经免疫通路中失调微生物代谢物易位进入循环激活神经炎症、神经内分泌层面下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴的负反馈调节受损，以及代谢通路中微生物源性神经活性物质对神经递质合成的直接影响。这些机制见解凸显了靶向肠道微生物干预策略的巨大转化潜力。

巴戟天寡糖（Morinda officinalis oligosaccharides, MOO）是从传统中药巴戟天中提取的天然活性成分，自2012年起被中国国家药品监督管理局批准作为处方抗抑郁药，在治疗轻中度抑郁症方面具有良好的安全性和临床疗效。值得注意的是，在一项包含1384例轻中度抑郁症患者的大规模队列研究中，MOO胶囊显示出不劣于氟西汀的治疗效果。然而，MOO的口服吸收较差，导致其在血液或脑中浓度极低，这一药代动力学特征提示肠道相关机制可能参与了MOO的抗抑郁作用。尽管已有研究将MOO处理与肠道微生物组成变化联系起来，但这些变化如何与其在PSD中的行为效应相关联仍不完全清楚。因此，本研究旨在探究两个关键问题：第一，MOO处理在PSD小鼠中引起的行为改善是否伴随肠道微生物组成和粪便丁酸水平的变化？第二，丁酸钠补充能否改善PSD相关的行为和屏障指标，海马Pla2g4a是否功能性地参与其行为效应？

二、研究方法概述

研究人员采用了综合性的多技术平台策略：首先建立了雄性C57BL/6J小鼠的PSD模型，即结合短暂大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, MCAO）与21天慢性束缚应激（chronic restraint stress, CRS）；通过灌胃给予MOO（50 mg/kg/天）或丁酸钠（30 mg/kg/天）进行干预；运用16S rRNA测序分析肠道微生物群落结构，液相色谱-串联质谱法检测粪便、血清和海马组织中的丁酸含量；通过免疫荧光染色和蛋白免疫印迹评估肠道和血脑屏障完整性；利用液相色谱-串联质谱联用的蛋白质组学技术筛选差异表达蛋白；采用供体对照粪菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）实验验证MOO相关粪便效应的可转移性；并通过腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导的海马Pla2g4a过表达验证其功能角色。

三、研究结果

3.1 MOO改善PSD小鼠的抑郁样行为并部分恢复肠道微生物稳态

研究人员采用PSD小鼠模型模拟人类疾病的发病过程和病理变化。激光散斑对比成像显示MCAO后1小时局部脑血流显著下降，独立模型验证队列的TTC染色证实了MCAO后24小时脑梗死形成。在旷场实验和高架十字迷宫实验中，与对照组相比，PSD小鼠在中央区域和开放臂的停留时间显著减少，MOO处理逆转了这些缺陷。在悬尾实验和强迫游泳实验中，PSD组的静止时间显著增加，MOO和氟西汀均显著降低了静止时间。16S rRNA测序显示MOO干预显著提高了Chao1指数、Simpson指数和Shannon指数等α多样性指标，β多样性分析显示MOO样本更接近对照样本聚类。支持向量机和随机森林算法鉴定出有益菌群在MOO处理后部分恢复，机会致病菌相对丰度降低。供体对照FMT实验显示，与接受载体处理PSD供体粪便的受体相比，接受MOO处理PSD供体粪便的受体在旷场实验中央区域和高架十字迷宫开放臂停留时间显著增加，在悬尾实验和强迫游泳实验中静止时间显著减少。SCFA分析表明PSD组总SCFA水平（82.19 μg/g）较对照组（276.72 μg/g）显著降低，尤其是丁酸，MOO干预显著恢复了总SCFA含量（217.52 μg/g）。

3.2 MOO处理与卒中后抑郁小鼠肠道和血脑屏障改善相关

结肠免疫荧光染色显示PSD显著降低了E-cadherin表达，MOO处理有效逆转了这一损失。蛋白免疫印迹和免疫荧光染色一致显示PSD组结肠紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1和Occludin显著下调，MOO处理部分逆转了这一变化。Evans蓝实验证实PSD小鼠血脑屏障受损，ELISA显示海马中炎症细胞因子水平显著升高。海马GFAP阳性星形胶质细胞呈现萎缩性变化，包括胞体缩小和突起回缩，MOO处理基本逆转了这些形态缺陷。海马紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1和Occludin的表达在PSD组显著抑制，MOO干预后得到恢复。c-Fos免疫荧光染色显示PSD显著减少了海马c-Fos阳性细胞数量，MOO处理显著逆转了这一减少，且大多数c-Fos阳性细胞与谷氨酸能神经元标志物CaMKIIα共定位。

3.3 Pla2g4a表达增加是PSD相关脂质代谢和信号转导通路的基础

海马蛋白质组学分析在PSD组与对照组间鉴定出55个上调蛋白和40个下调蛋白，在MOO组与PSD组间鉴定出49个上调蛋白和47个下调蛋白。基因本体论富集分析识别出“细胞组分组织或生物发生”、“细胞解剖实体”和“蛋白质结合”等显著条目，京都基因与基因组百科全书通路分析揭示这些差异表达蛋白主要涉及“α-亚麻酸代谢”、“钙信号通路”和“cAMP信号通路”。韦恩分析鉴定出一个由9个差异表达蛋白组成的核心集合，其中PSD诱导的上调被MOO干预逆转，这些重叠蛋白主要集中于“脂质代谢”和“信号转导”通路，包括Acox1、Pla2g4a和脑源性神经营养因子。免疫荧光和蛋白免疫印迹验证了Pla2g4a在PSD组高表达、MOO处理后低表达的模式。在PSD组中，Pla2g4a免疫反应性主要在神经元中检测到，也在Iba1阳性小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞中观察到。丁酸水平与Pla2g4a表达呈负相关。

3.4 丁酸盐减轻行为、肠道屏障和血脑屏障缺陷并抑制Pla2g4a

丁酸钠补充显著增加了粪便、血清和海马组织中的丁酸浓度。行为学测试显示丁酸钠处理显著增加了PSD小鼠在旷场实验中央区域的停留时间，在悬尾实验和强迫游泳实验中显著减少了静止时间，但在高架十字迷宫开放臂停留时间虽有增加趋势但未达到统计学显著性。蛋白免疫印迹和免疫荧光分析显示丁酸钠处理部分恢复了结肠和海马的紧密连接蛋白表达，并显著降低了Pla2g4a蛋白水平。

3.5 海马Pla2g4a过表达减弱丁酸钠诱导的PSD小鼠行为改善

通过CMV启动子驱动的AAV在海马中过表达Pla2g4a，蛋白免疫印迹验证了293T细胞和小鼠海马组织中Pla2g4a蛋白水平的显著升高。行为学测试确认PSD小鼠表现出稳健的抑郁样行为，丁酸钠处理显著改善了这些行为缺陷。关键的是，海马Pla2g4a过表达在所有测试中部分削弱了丁酸钠的治疗益处，包括减少探索活动和增加静止时间。

四、讨论与结论

研究人员在讨论中指出，MOO缓解了PSD小鼠的肠道微生物失调，表现为α和β多样性的恢复、有益菌丰度增加和潜在有害菌丰度减少，这与之前在大鼠抑郁模型中观察到的结果一致。伴随总SCFA特别是丁酸的升高，MOO促进了肠道和海马屏障的修复，部分恢复了紧密连接蛋白表达并减轻了星形胶质细胞萎缩。这些保护效应的潜在机制可能与SCFA水平变化有关，丁酸可通过激活G蛋白偶联受体和抑制组蛋白去乙酰化酶双重途径促进紧密连接组装。

通过海马蛋白质组学分析，研究人员将Pla2g4a确定为MOO介导通路中的候选分子。Pla2g4a编码胞质型磷脂酶A2α，是催化膜磷脂水解释放花生四烯酸的限速酶，在应激诱导的抑郁模型中其表达显著升高，活性与促炎细胞因子水平和抑郁样行为严重程度正相关。此外，一项独立的缺血性脑卒中研究也鉴定Pla2g4a为候选差异蛋白，其靶向抑制在体外PC12细胞缺血模型中发挥明确的神经保护作用。

关于丁酸的作用机制，外源性丁酸钠补充改善了PSD小鼠的抑郁样行为，这与慢性不可预测温和应激模型中的抗抑郁效应一致。丁酸还可通过多种机制加强血脑屏障，包括促进脑血管内皮细胞紧密连接蛋白表达、调节周细胞功能稳定神经血管单元，以及调节小胶质细胞-内皮细胞相互作用改善应激诱导的血脑屏障渗漏。

海马Pla2g4a过表达部分减弱了丁酸钠的抗抑郁效应，支持Pla2g4a作为连接肠道代谢物与中枢行为调控的候选下游介质。研究人员提出了一个工作模型：口服MOO与肠道微生物组成和粪便SCFA水平的变化相关，MOO和丁酸钠处理也与屏障相关指标的改善和海马Pla2g4a表达降低相关。

研究结论：MOO处理与PSD小鼠抑郁样行为的改善相关，伴随肠道微生物改变、粪便丁酸增加、屏障完整性改善和海马Pla2g4a表达降低。FMT发现提供了初步证据，表明来自MOO处理供体的可粪便转移因子可能促进行为改善，而Pla2g4a过表达减弱了丁酸钠的行为效应。这些发现强调了MOO、肠道源性丁酸、屏障完整性和海马Pla2g4a在PSD中的潜在关联。