西兰花叶提取物分级组分的生物刺激活性：小白菜幼苗生长促进与细菌生物膜诱导

《Scientia Horticulturae》：Fractionation of broccoli leaf extracts: Biostimulant activity on pak choi and induction of bacterial biofilms

　　

摘要翻译：西兰花副产物提取物含有功能不同的生物刺激组分，这些组分与矿质平衡及代谢物相关。西兰花副产物提取物的Bio-Beads滤液促进小白菜（pak choi）幼苗根伸长。Sephadex柱所得组分3主要与生物量积累增加相关。离子平衡是与生长相关性最强的因素，而抗氧化特性发挥次要作用。不同组分刺激Bacillus形成生物膜，提示其对有益根际互作具有影响。

研究背景：长期施用化学肥料带来负面效应，使可持续农业投入品受到关注。生物刺激剂（biostimulants，可调节植物代谢并提高养分利用效率、抗逆性和品质，且不依赖养分直接供应）成为替代选择。植物源生物刺激剂可利用富含生物活性物的农业废弃物。西兰花（Brassica oleracea L. var. italica）可食部分仅约25%，大量叶和茎副产物未充分利用。前期研究表明，西兰花副产物提取物可提高Brassica盐胁迫耐受和生长，含矿质养分、有机酸、糖、氨基酸、酚类、硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GSLs）及少量激素；纯GSLs亦可促进幼苗生长。但复杂混合物中哪些成分负责促生尚不清楚，分级是识别活性组分的必要手段。提取物中糖、氨基酸、酚类也可能作为根际信号影响根际微生物，并可能刺激根相关生物膜形成。因此，本研究旨在分级西兰花提取物，找出促进小白菜（Brassica rapa var. chinensis）幼苗生长的组分，并检验各组分是否刺激根际细菌生物膜形成，以解析植物源生物刺激剂机制并支持精准配方。

关键技术方法：样品为CEBAS-CSIC实验农场（Santomera, Murcia, Spain）冬季地中海气候下栽培的西兰花‘Ulises’叶和茎，冻干后以70%甲醇（v/v）1:10提取。采用差速离心、12 kDa透析、蔗糖梯度等密度离心、Sephadex G25尺寸排阻和Bio-Beads SM-2吸附分级，得到差速离心上清（DCS）与沉淀（DCP）、透析内部2 h/4 h（DI2/DI4）、等密度离心（IC）、Sephadex全组分及1–3相（Sep、SepP1–P3）、Bio-Beads滤液（BBF）与洗脱物（BBW）。用Bradford法测蛋白、DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）自由基法测抗氧化、ICP-OES（inductively coupled plasma optical emission spectrometry，电感耦合等离子体发射光谱）测矿质、¹H-NMR测初生代谢物、HPLC-Q-TOF-MS测GSLs和酚类。小白菜种子在含分级物稀释液的琼脂上培养8天，测鲜重（fresh weight，FW）和根长；以Bacillus velezensis结晶紫染色评价生物膜；进行相关分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

结果：3.1 对Brassica rapa幼苗的生物刺激效应：以FW和根长为指标，8天后DCS、DI4、IC、Sep、SepP1、SepP3、BBF、BBW较对照提高FW，多数在1:40最强；DCS、Sep、SepP3、BBF的生长模式类似粗提物。根长方面，粗提物呈正效应；Sep、SepP3、BBF刺激根长，BBF强于粗提物；DCP、DI4、SepP1降低根长。表明不同分级组分功能不同，BBF促根突出。3.2 蛋白表征和抗氧化能力评价：Bradford显示DCS、DI2、DI4蛋白浓度最高；BBF/BBW未检出蛋白。DPPH显示DI2、DI4、Sep、SepP3抗氧化能力提高，其余等于或低于粗提物。3.3 选定组分的扩展表征：3.3.1 矿质含量分析：ICP-OES表明多数分级物矿质低于粗提物，DCS多数元素与粗提物无显著差异，但铁显著降低。3.3.2 次生代谢物分析：HPLC-MS显示分级影响酚酸和GSLs。异香草酸在DI4增加，Sep/SepP3略增；咖啡酸在Sep增加，在DI4/SepP3/BBW几乎检测不到；绿原酸多数稳定，SepP3和BBW降低；GRA（glucoraphanin）在DI4和SepP3增加；GBA（glucobrassicin）在SepP3、BBF、BBW降低。3.4 全局分析：总体数据中蛋白浓度与FW/根长无显著相关；抗氧化能力与FW正相关（r=0.373，p<0.001），与根长较弱正相关（r=0.229，p<0.05）。综合生长指数显示BBF 1:40最强，其次粗提物1:40/1:80、SepP3 1:40、BBF 1:80；DI4、BBW及BBF 1:160无增强或负效应。FW评分模式类似综合指数，FW是综合响应主驱动；根长评分中BBF 1:40最强。相关分析显示FW与大量和微量元素、GBA、绿原酸、咖啡酸强正相关；PCA前两维解释94.4%方差（PC1 77.6%，PC2 16.8%），养分与FW关联，Sep/SepP3/DCS与生物量增加聚类；GRA与生物量弱关联，GBA更明显；DI/BBW远离生长变量，生化谱有限、促生低；BBF、SepP3、Sep、DCS和粗提物与FW增加正相关。3.5 生物膜形成：粗提物和DCS（1:40）强烈刺激Bacillus velezensis生物膜，接近阳性对照300%；DI4、Sep、SepP3、BBW在两种稀释度下降低生物膜形成；除DCS和BBF 1:40外多数未增强，部分抑制。表明提取物及特定组分可调节根际细菌生物膜形成，呈浓度依赖。

讨论总结：讨论指出农化品限制促使寻找可持续替代，生物刺激剂机制理解受复杂化学组成限制，分级和纯化合物测试可识别活性物。DCS富集可溶性蛋白，保留类似粗提物促生活性，提示蛋白可能作为底物或信号支持根际动态和微生物互作，但效应分布多化学类。Sep和SepP3抗氧化活性高，与生物量和根长增加正相关；SepP3除GRA外多数分析代谢物较低，其高抗氧化和促生可能与未检测化合物或更有利平衡（含矿质养分）有关。BBF是唯一持续复制粗提物效应的组分，含极性低亲和树脂化合物如糖、有机酸、氨基酸；无Bradford可检出蛋白，可能与高游离氨基酸有关。功能分工表现为BBF主促根，SepP3主增FW。BBF根促效应可能由氨基酸和小分子早期触发；其极低Fe:Mn比（0.022 vs 粗提物0.126）可能通过Mn/Fe竞争IRT1，引发Fe缺乏信号，重塑根构型。SepP3总矿质较低，但K/(Ca+Mg)比低于粗提物（1.65 vs 3.88），减轻K⁺对Ca²⁺/Mg²⁺吸收的离子拮抗，利于细胞稳定和生物量积累，并可能有更优次生代谢物平衡/协同。全局分析显示矿质含量与FW正相关，但元素平衡同样关键；生物刺激活性可能来自矿质谱与生物活性代谢物的稳态平衡而非传统肥料作用，并可能涉及根际微生物动态。粗提物、BBF、DCS促进细菌生物膜；根际生物膜可保护植物促生根际细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）、促进群体感应和生物固氮。酚类、有机酸、特定氨基酸是生物膜组装诱导物；BBF促生物膜可能与次生代谢物和氨基酸信号富集有关，DCS可能与易利用碳源提供胞外聚合物基质（extracellular polymeric matrix，EPS）合成能量有关。

研究结论翻译：综上所述，本研究表明BBF是唯一能持续复制粗提物在幼苗建立中效应的组分。其显著促进根生长与氨基酸、低分子量化合物及特定Fe:Mn比有关，后者可能作为调节根发育的信号，并可能与微生物活性互作。研究识别出清晰功能分工：BBF是根发育主要驱动者，SepP3是增加总FW最有效组分。此效应归因于减轻矿质拮抗的优化离子平衡和更优抗氧化活性。这些提取物的生物活性根本上由氨基酸含量和稳态矿质平衡决定，而非总蛋白组分。此外，组分的固有氧化还原电位可作为有效性可靠指标，因其与生物量增加正相关。BBF和DCS与粗提物一起将生物影响扩展到植物之外，促进细菌生物膜形成，提示根际潜在有益微生物关联。最终，西兰花提取物分级有助于识别对幼苗生长和细菌生物膜形成具有不同活性的组分，为更精准配方及进一步评价植物–微生物互作效应提供基础。