百合灰霉病抗性负调控因子LrNCED5-1与LrNCED5-2的功能解析

《Scientia Horticulturae》：Functional analysis reveals the negative role of LrNCED5-1 and LrNCED5-2 in lily resistance to gray mold

　　

： 功能分析揭示LrNCED5-1和LrNCED5-2在百合灰霉病抗性中的负调控作用 • 在三种百合属（Lilium）物种的基因组中鉴定出72个NCED基因。 • LrNCED5–1/5–2负调控百合花瓣对灰霉病的抗性。 • LrNCED5–1/5–2参与调控百合花瓣中脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）和1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的含量。 植物灰霉病由真菌属葡萄孢属（Botrytis）引起，该属包含约35个物种。除一个例外，所有成员均表现出坏死营养型侵染行为，即杀死寄主植物细胞并从死亡组织中获取营养（Valero-Jiménez等，2019）。许多具有重要经济价值的观赏球根花卉作物，包括百合、郁金香、水仙和唐菖蒲，均被各自寄主特化的葡萄孢属（Botrytis）物种侵染（Staats等，2005）。病原菌椭圆葡萄孢（B. elliptica）最初从病百合中分离，主要通过释放特异性触发细胞死亡的效应因子来攻击叶片、花组织和茎部，导致百合生产遭受重大经济损失（Bin Terhem等，2015）。培育抗性品种是防治百合灰霉病的有效策略。迄今为止，百合属（Lilium）中尚未发现对该病害完全抗性的物种或品种。部分抗性主要见于某些东方杂种和东方×喇叭杂种品种（Gao等，2018）。中国拥有丰富的百合属（Lilium）种质资源，其中一些（如岷江百合L. regale）也表现出对椭圆葡萄孢（B. elliptica）侵染的抗性（Gao等，2020）。因此，利用这些资源阐明百合对葡萄孢属（Botrytis）侵染的防御反应，并对关键抗性相关基因进行功能鉴定，将有助于开发高抗种质和实施可持续的病害管理策略。 百合对灰霉病的抗性是一个典型的数量性状（Hu等，2017）。目前，已在百合中鉴定出多个参与灰霉病防御反应的基因，包括编码病程相关蛋白5和10（PR5/10）、富含甘氨酸蛋白（GRP）以及转录因子WRKY4、WRKY12和WRKY33的基因（Wang等，2017a；Cui等，2018；Chai等，2021；Du等，2023）。此外，已对多个参与百合响应葡萄孢属（Botrytis）侵染的转录调控模块进行了功能鉴定。例如，lre-miR159a-LrGAMYB模块主要通过调控茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）通路赋予岷江百合（L. regale）灰霉病抗性（Gao等，2020），而LlWRKY33介导的LlHSFA4-LlCAT2模块通过抑制细胞死亡和活性氧（ROS）积累来增强麝香百合（L. longiflorum）的灰霉病抗性（Ding等，2024）。近期一项研究表明，三种苯丙素类化合物，包括圣草酚、阿魏酸和芥子醇，在椭圆葡萄孢（B. elliptica）侵染后在抗性和感病百合品种间差异积累，可能作为百合灰霉病抗性的潜在标记代谢物（Cui等，2024）。 脱落酸（ABA）已被证实参与植物-微生物互作。它通常促进病害发展，尤其是在灰葡萄孢（B. cinerea）侵染期间。例如，拟南芥（Arabidopsis thaliana）的ABA生物合成突变体abscisic aldehyde oxidase 3–2（aao3–2）和aba deficient 2–12（aba2–12），以及下游信号突变体aba insensitive 4（abi4），均表现出对灰葡萄孢（B. cinerea）增强的抗性（Asselbergh等，2008）。类似地，施用ABA会损害番茄（Solanum lycopersicum）对灰霉病的抗性，而ABA缺陷的sitiens突变体表现出改变的表皮通透性和果胶组成，从而赋予对该病害增强的抗性（Audenaert等，2002；Achuo等，2006；Curvers等，2010）。在植物中，NCED是ABA生物合成中的关键酶，催化9-顺式-环氧类胡萝卜素的特异性裂解，产生ABA前体黄氧素（xanthoxin）（Li等，2024）。已在多种植物中鉴定出NCED家族成员，包括拟南芥中的5个（Wan和Li，2006）、水稻（Oryza sativa）中的5个（Chen等，2022）和番茄中的11个（Chen等，2024）。NCED基因家族也已在几种观赏物种中得到鉴定，包括百脉根（Lotus tenuis）（Espasandin等，2014）、梅（Prunus mume）（Chen等，2023b）和金银花（Lonicera japonica）（Lei等，2025）。越来越多的证据表明，NCED基因在植物对各种胁迫的响应中发挥重要作用。例如，水稻（Oryza sativa）中OsNCED3的表达受NaCl、PEG和H2O2处理显著诱导。OsNCED5突变体对水分胁迫表现出增强的敏感性，而OsNCED5的过表达则增加干旱响应（Huang等，2018）。类似地，SlNCED2沉默的番茄植株表现出ABA水平显著降低和干旱耐受性受损（Chen等，2024）。NCED在植物-坏死营养型病原菌互作中也发挥关键调控作用。在拟南芥（A. thaliana）中，wrky33突变体表现出NCED3/5表达升高和ABA积累增加，导致对灰葡萄孢（B. cinerea）的抗性减弱（Liu等，2015）。在菊花-链格孢（Alternaria alternata）互作中，病原菌分泌的效应蛋白Aa593促进CmNCED3转录，导致ABA积累并降低对链格孢（A. alternata）的抗性（Dong等，2025）。 尽管NCED基因已被证实参与调控百合属（Lilium）花粉败育（Zhou等，2025），但关于NCED介导的ABA通路在百合响应椭圆葡萄孢（B. elliptica）侵染中的作用却鲜有关注。此外，NCED基因家族在百合属（Lilium）中的基因组分布和进化情况在很大程度上仍属未知。中国拥有丰富的百合属（Lilium）种质资源，其中许多对育种具有重要价值。例如，岷江百合（L. regale）以其对生物和非生物胁迫的强抗性而著称（Sun等，2025b）。作为喇叭杂种和东方×喇叭杂种品种的主要祖先亲本，淡黄花百合（L. sargentiae）为品种创新提供了基础支持（Liang等，2025）。此外，兰州百合（L. davidii var. unicolor）作为中国兰州地区唯一的食用甜百合，也是遗传改良的宝贵资源（Xu等，2024）。目前，百合属（Lilium）内仅有岷江百合（L. regale）、淡黄花百合（L. sargentiae）和兰州百合（L. davidii var. unicolor）的基因组数据可用，这为NCED基因家族的全基因组鉴定提供了机会（Xu等，2024；Liang等，2025；Sun等，2025b）。为研究NCED基因在百合响应椭圆葡萄孢（B. elliptica）侵染中的作用，研究人员首先采用生物信息学方法从岷江百合（L. regale）、兰州百合（L. davidii var. unicolor）和淡黄花百合（L. sargentiae）的基因组中鉴定NCED基因，并分析其序列特征和进化特性；进一步比较了抗性和感病百合中NCED基因及其他ABA通路相关基因对椭圆葡萄孢（B. elliptica）侵染的响应表达模式。此外，通过百合花瓣中的瞬时沉默和过表达，阐明了两个关键成员LrNCED5–1和LrNCED5–2的功能。该研究阐明了百合中NCED家族的进化模式及结构/功能分化，并为百合灰霉病抗性的调控机制提供了更深入的认识。

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一、研究背景与科学问题

百合灰霉病是由真菌椭圆葡萄孢（Botrytis elliptica）引起的严重病害，该病原菌通过释放效应因子触发寄主细胞死亡，从死亡组织中获取营养，对百合生产造成重大经济损失。目前百合属（Lilium）内尚未发现完全抗性品种，仅部分东方杂种和东方×喇叭杂种品种表现出部分抗性。中国拥有丰富的百合种质资源，其中岷江百合（L. regale）表现出对椭圆葡萄孢较强的抗性，为解析抗病机制提供了宝贵材料。

脱落酸（ABA）已被证实广泛参与植物-微生物互作，通常促进病害发展，尤其在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染期间。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是ABA生物合成中的关键限速酶，催化9-顺式-环氧类胡萝卜素裂解产生ABA前体黄氧素。尽管NCED基因在植物非生物胁迫响应中的作用已有大量研究，但其在百合响应椭圆葡萄孢侵染中的功能尚不清楚。此外，NCED基因家族在百合属中的基因组分布和进化特征也缺乏系统研究。基于此，研究人员利用三种百合物种的基因组数据开展全基因组水平的NCED基因家族鉴定与功能分析，重点解析LrNCED5-1和LrNCED5-2在百合灰霉病抗性中的调控作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员在岷江百合（L. regale）、淡黄花百合（L. sargentiae）和兰州百合（L. davidii var. unicolor）三个物种的基因组中鉴定出72个NCED基因，其中兰州百合含有最多（37个），岷江百合和淡黄花百合分别含有21个和14个。系统发育分析将百合NCED家族成员划分为五个亚组（Group I-V），其中Group II成员与拟南芥和水稻中已知参与ABA生物合成的NCED基因聚为一支。染色体定位分析显示NCED基因在染色体上分布不均，12号染色体含有最多NCED基因，且11号染色体上未检测到NCED基因。基因重复事件分析发现多个串联重复基因对，所有重复基因对的Ka/Ks比值均小于1，表明这些基因经历了纯化选择。共线性分析仅在岷江百合内部发现一对共线性基因（LrNCED2/LrNCED3），并鉴定出百合与水稻间的直系同源基因对。保守基序和结构域分析显示，大多数百合NCED蛋白仅含有一个RPE65结构域，部分基因含有多个结构域，体现了功能分化。基因结构分析发现内含子数量从0到15不等，22.22%的NCED基因长度超过50 kb，属于超长基因，其延长主要源于内含子扩张。顺式作用元件分析在NCED基因启动子区域鉴定出多种与光响应、胁迫响应、激素调控和植物发育相关的元件，其中MYB和MYC识别位点普遍存在。

转录组数据分析显示，在椭圆葡萄孢侵染后，感病品种'Tresor'中ABA生物合成基因（LhZEP、LhNCED1/LhNCED2）和信号转导基因（LhPYR/PYL、LhSnRK、LhABF）的表达水平显著高于抗病品种'Sorbonne'，提示ABA通路可能负调控百合灰霉病抗性。研究人员进一步从岷江百合中克隆了LhNCED-1和LhNCED-2的同源基因，命名为LrNCED5-1和LrNCED5-2，二者分别编码603和574个氨基酸，氨基酸序列一致性为68%。表达模式分析显示，两个基因在茎和花中高表达，受外源ABA处理显著诱导，并在椭圆葡萄孢侵染后呈上调表达趋势，但感病品种'Tresor'中的表达水平显著高于抗性岷江百合。

功能验证实验采用瞬时过表达和病毒诱导基因沉默（VIGS）技术在'Sorbonne'花瓣圆片中进行。结果显示，过表达LrNCED5-1和LrNCED5-2分别使病斑面积增加至对照的1.56倍和1.72倍，而沉默这两个基因使病斑面积分别降至对照的52.27%和40.91%，证实LrNCED5-1和LrNCED5-2负调控百合花瓣对椭圆葡萄孢的抗性。激素含量测定表明，过表达LrNCED5-1和LrNCED5-2使ABA含量分别增加3.16倍和4.09倍，GA₃含量分别增加0.51倍和1.63倍，而ACC含量分别降低14.08%和27.74%；沉默处理则产生相反效应，其中LrNCED5-1沉默花瓣中未检测到ABA，LrNCED5-2沉默花瓣中未检测到GA₃。这些结果表明两个基因参与调控ABA、GA₃和ACC含量，可能通过激素间的协同或拮抗作用影响百合灰霉病抗性。

三、主要技术方法

研究人员首先利用HMMER软件和BLASTP搜索从三种百合物种基因组中鉴定含有NCED结构域（PF03055）的候选蛋白，并通过Pfam、NCBI CD-Search和SMART进行保守结构域验证。系统发育分析采用MUSCLE进行多序列比对，使用IQ-TREE构建最大似然树。基因重复和共线性分析使用MCscanX和TBtools完成，Ka/Ks值通过TBtools计算。顺式作用元件使用PlantCARE预测。基因表达分析采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR），以EF1基因为内参。功能验证采用农杆菌介导的瞬时过表达和VIGS沉默技术，在'Sorbonne'花瓣圆片上进行。植物激素含量（ABA、GA₃和ACC）采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台测定。实验材料包括岷江百合、东方杂种'Sorbonne'和亚洲杂种'Tresor'，病原菌为从病百合叶片分离的椭圆葡萄孢菌株。

四、讨论与结论

讨论部分指出，百合NCED基因家族的显著扩张主要源于串联重复事件，所有重复基因对均经历纯化选择，蛋白水平上保持保守性。超长基因的存在与百合基因组中转座子插入导致的内含子扩张有关，这些基因仍能正确转录和剪接，且可能参与环境适应。启动子区域中ABA响应元件（ABRE）和茉莉酸（JA）响应元件的共存提示ABA与JA信号通路可能共同调控百合NCED基因表达。花瓣圆片比叶片圆片更适合灰霉病症状观察，因为花瓣更薄，有利于真菌穿透和侵染。激素分析结果与已有研究一致，即ABA和GA₃是番茄灰霉病抗性的负调控因子，GA与乙烯（ET）在果实成熟中通常表现拮抗作用。LrNCED5-1和LrNCED5-2可能通过协同调控ABA、GA₃和ACC代谢来负调控百合灰霉病抗性。由于LrNCED5启动子含有MYB和MYC结合位点，未来可研究这些转录因子是否参与调控这两个基因的表达。

研究结论：在岷江百合、淡黄花百合和兰州百合中鉴定出72个NCED家族成员，系统分析了其分类、染色体位置、进化关系、保守结构域、基序组成、内含子-外显子结构和顺式作用元件。转录组分析显示，大多数ABA相关基因在感病百合中的转录水平高于抗病百合。从岷江百合中克隆并详细鉴定了LrNCED5-1和LrNCED5-2两个基因，二者在不同组织中差异表达，受ABA和椭圆葡萄孢处理诱导。功能分析证明这两个基因负调控百合花瓣对椭圆葡萄孢的抗性，并参与调控ABA、GA₃和ACC含量。该研究为百合灰霉病抗性的潜在调控机制提供了见解，为改良百合灰霉病抗性的分子育种提供了直接遗传靶点，同时丰富了NCED基因家族在观赏植物中的功能研究数据。