《Reproductive Biology》：Sleep deprivation compromises sperm quality and early embryo development by disrupting folate metabolism and DNA repair
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摘要睡眠剥夺（SD）是现代生活中普遍存在的问题，它与男性生殖功能障碍有关，但其背后的分子机制仍不完全清楚。在小鼠模型中，持续的睡眠剥夺会引发生殖细胞凋亡、降低精子活力，并增加形态异常。此外，睡眠剥夺还会损害精子的受精能力，影响胚胎的着床前发育。蛋白质组分析发现SLC46A1（一种
摘要
睡眠剥夺（SD）是现代生活中普遍存在的问题，它与男性生殖功能障碍有关，但其背后的分子机制仍不完全清楚。在小鼠模型中，持续的睡眠剥夺会引发生殖细胞凋亡、降低精子活力，并增加形态异常。此外，睡眠剥夺还会损害精子的受精能力，影响胚胎的着床前发育。蛋白质组分析发现SLC46A1（一种质子耦合的叶酸转运蛋白）是睾丸组织和精子中唯一显著下调的蛋白质。同时，叶酸代谢的关键酶——亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的表达也显著减少，核心DNA修复蛋白RAD51和TOPBP1的水平也降低。值得注意的是，在睡眠剥夺之前和期间补充叶酸可以部分恢复MTHFR、RAD51和TOPBP1的表达，这表明增加叶酸的可用性可以抵消部分由睡眠剥夺引起的分子变化。总体而言，我们的研究结果表明，睡眠剥夺通过干扰叶酸的转运和代谢，可能损害精子的DNA修复能力，从而影响精子质量和胚胎发育。因此，针对叶酸代谢的干预可能是一种缓解睡眠剥夺相关男性不育的治疗策略。
引言
不孕症是一个全球性的问题，其中30%至50的不孕症病例与男性因素有关[1]。临床上，男性不育主要表现为无精症、精子数量减少、精子活力降低或受精能力受损[2]。作为父系基因组的携带者，精子DNA的完整性与早期胚胎发育和成功着床密切相关[3,4]。许多风险因素与精子DNA片段化（SDF）有关，包括精索静脉曲张、氧化应激、感染、高龄、癌症治疗，以及不健康的生活方式，如肥胖、吸烟、饮食不均衡、心理压力和睡眠障碍[5],[6],[7]。
睡眠是一种跨物种普遍存在的行为，主要由稳态过程和昼夜节律调节[8,9]。睡眠期间许多重要功能都能得到调节或恢复，包括血压、心率、激素分泌、免疫防御功能、细胞修复、温度调控、记忆能力的恢复以及认知功能[10,11]。然而，睡眠剥夺可能由轮班工作、压力、睡前使用媒体和电子设备等因素引起，也可能与睡眠障碍（如失眠、不安腿综合征（RLS）、周期性肢体运动（PLM）和睡眠呼吸障碍（SBD）有关[11,12]。因此，睡眠剥夺与内分泌紊乱、代谢紊乱、免疫紊乱和心血管紊乱有显著关联[11,13]。在男性生殖背景下，睡眠剥夺会扰乱下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的功能，导致激素失衡，从而影响生殖健康[14,15]。尽管已有研究表明睡眠剥夺对男性生殖有影响，但这些研究主要是现象学层面的，主要记录了精子参数、精液质量、性欲、性激素和睾丸组织结构的变化[15],[16],[17],[18]。然而，关于氧化应激[17]、细胞凋亡[14]、免疫环境[19]、血液-睾丸/附睾屏障破坏[18]以及精子DNA损伤[14,20]等机制的研究还停留在初步阶段，核心的分子和细胞机制仍有待发现。
SLC46A1是一种高亲和力的质子耦合叶酸转运蛋白，其功能受损在胚胎发育中是致命的[21],[22],[23]。叶酸作为一碳单位的供体和脱氧嘌呤合成的底物，在DNA合成和修复中起着关键作用。叶酸代谢紊乱会导致胚胎发育迟缓和胎盘异常[24,25]。在叶酸不足的情况下，尿嘧啶向胸腺嘧啶的转化受阻，从而导致DNA损伤[24,26]。此外，叶酸缺乏还会影响同型半胱氨酸的甲基化，使其积累。同型半胱氨酸水平升高可引发DNA链断裂、氧化应激、细胞凋亡以及一氧化氮（NO）的生物利用度下降，进而影响阴茎勃起、血液-睾丸屏障、精子活力、顶体反应和受精能力，最终导致男性不育[26],[27],[28],[29]。总之，这些发现表明SLC46A1可能通过干扰铁稳态和叶酸转运，从而损害精子的DNA合成和修复能力，导致男性不育。然而，SLC46A1是否参与睡眠剥夺引起的精子生成障碍尚不明确。
基于以上考虑，本研究旨在阐明睡眠剥夺引起男性不育的机制。我们对睡眠剥夺小鼠的睾丸、附睾组织及精子进行了组织和功能分析。蛋白质组分析显示，在睡眠剥夺条件下，SLC46A1是睾丸和精子中唯一显著下调的蛋白质。此外，我们还观察到精子中MTHFR（叶酸代谢的关键酶）的表达显著降低，这表明叶酸转运和利用途径受到更广泛的破坏。这些变化伴随着核心DNA修复蛋白（如RAD51和TOPBP1）表达的下降以及精子凋亡的增加。为了进一步验证这一途径的功能重要性，我们在睡眠剥夺小鼠中进行了叶酸补充实验。结果表明，外源性叶酸的补充部分恢复了MTHFR、RAD51和TOPBP1的表达，并显著降低了精子凋亡，表明增加叶酸的可用性可以抵消睡眠剥夺引起的分子和功能缺陷。这些发现进一步表明，叶酸补充可能是一种缓解睡眠剥夺相关男性不育的潜在策略。
章节片段
动物、处理方法和样本收集
实验所用的是来自中国北京Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.的6周龄ICR雄性小鼠。经过7天的标准饲养条件（温度：23±2°C，湿度：55±5%，12小时光照/黑暗周期）适应期后，所有动物实验开始[30]。实验方案得到了江西省妇幼保健医院动物护理和使用委员会（ACUC）的批准，并付出了巨大的努力。
睡眠剥夺导致小鼠生殖细胞凋亡
为了研究睡眠剥夺对精子生成的影响，我们建立了一个持续旋转装置的小鼠模型，使小鼠在10天内保持24小时的清醒状态（图1）。实验过程中监测了小鼠的体重。基线时（第0天），对照组和睡眠剥夺组的体重无明显差异（31.500±2.029 vs. 31.009±2.410，P=0.9958）。然而，从第1天到第9天，睡眠剥夺组的小鼠体重显著降低
讨论
睡眠剥夺已成为一种日益普遍的现代生活方式，对男性生殖健康构成了严重威胁。我们的研究结果与先前报道一致，表明睡眠剥夺会降低精子活力并导致功能受损。然而，现有的研究主要集中在神经内分泌调节或炎症反应途径上[17,46,47]。全面系统地理解睡眠剥夺背后的核心分子机制仍然是必要的。
结论
总之，本研究显示睡眠剥夺会引发小鼠生殖细胞凋亡，降低精子活力和形态，影响受精能力和胚胎的着床前发育。蛋白质组分析发现SLC46A1是睾丸和精子中唯一显著下调的蛋白质，同时MTHFR的表达降低，核心DNA修复蛋白RAD51和TOPBP1也减少。叶酸补充部分逆转了这些异常
伦理声明
本研究遵循了ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究得到了江西省妇幼保健医院的批准。
伦理审批
本研究得到了江西省妇幼保健医院动物护理和使用委员会（ACUC）的批准（批准编号：2406117）。
资助
本研究得到了以下机构的支持：国家自然科学基金[资助编号：82560293]；江西省科技厅科研项目[资助编号：20232BAB216024, 20252BAC240538]；江西省科技厅杰出青年基金[20224ACB216005]；以及吴杰平医学基金会[320.6750.2023–06–93]。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者衷心感谢江西省妇幼保健医院生殖医学中心同事的支持与帮助，同时也感谢JXHC生育保存重点实验室的支持。
张一清|钟玉飞|周青|刘培培|曹丽云|张志勤|赵燕|潘泽铮|谭俊|李鑫
