拟南芥NFS1-ISD11-FH亚复合体连接Fe-S簇组装与血红素生物合成并调控过氧化氢酶活性

《Plant Physiology and Biochemistry》：The Fe-S cluster assembly NFS1-ISD11-FH subcomplex is involved in heme biosynthesis in plants

　　

铁硫（Fe-S）簇组装NFS1-ISD11-FH亚复合体参与植物血红素（heme）生物合成。拟南芥血红素含量与AtNFS1表达直接相关。氯化血红素（hemin）可完全恢复atnfs1突变体中降低的过氧化氢酶（catalase）活性。AtFH与AtNFS1表达降低对血红素含量具有叠加效应。铁硫簇组装（ISC）机器与血红素生物合成在植物线粒体中存在功能联系。

研究背景：真核半胱氨酸脱硫酶NFS1为吡哆醛磷酸（PLP）依赖的同源二聚体，以L-半胱氨酸为底物产生L-丙氨酸和蛋白结合过硫化物，主要定位于线粒体，并与ISD11（NFS1稳定蛋白）、酰基载体蛋白（ACP）、frataxin（FH，铁稳态与Fe-S簇生物合成蛋白）及ISU1-3支架蛋白形成异源复合体，催化Fe-S簇合成与成熟的第一步。Fe-S簇是参与电子传递、铁硫储存、基因表达调控、光合作用及多种酶活性的古老多功能辅因子；半胱氨酸是还原硫的主要来源，Fe-S簇合成需还原硫与螯合铁按精确化学计量供给，提示铁硫代谢需协调。血红素是另一含铁辅基，由原卟啉IX经ferrochelatase（FC，亚铁螯合酶）插入Fe²⁺形成。高等植物血红素合成定位于质体，但植物线粒体持续检测到ferrochelatase活性，而经典FC1和FC2并不在线粒体。酵母线粒体Fe-S蛋白生物合成缺陷会降低细胞色素等血红素蛋白水平；植物frataxin参与血红素合成，可能作为铁插入的替代途径。研究人员此前证明拟南芥frataxin可在体外催化Fe²⁺插入原卟啉IX，且AtNFS1和AtISD11增强该活性。因此，本研究旨在进一步阐明线粒体ISC组装机器与血红素合成通路的功能关系，聚焦NFS1-ISD11-FH亚复合体，分析AtNFS1和AtFH表达改变植株中血红素合成基因表达、总血红素含量及血红素蛋白活性。

研究人员使用拟南芥Col-0野生型、AtNFS1启动子区T-DNA插入突变体atnfs1-1（SALK_000501）和atnfs1-2（SALK_083681，来自Salk Institute T-DNA Express Collection）及先前构建的AtNFS1过表达株；植株生长至1.05期约15天。关键技术包括非共价结合血红素含量测定、qRT-PCR（定量实时PCR）分析血红素合成及过氧化氢酶基因、总过氧化氢酶活性测定、线粒体纯化、hemin或原卟啉IX处理离体线粒体、农杆菌介导AtFH反义构建体瞬时转化，以及ANOVA（方差分析）和Spearman相关分析。

结果：3.1 血红素含量与血红素途径转录水平（Heme content and heme pathway transcript levels in AtNFS1 mutant and overexpressing lines）：通过血红素定量和qRT-PCR发现，AtNFS1表达改变使莲座叶血红素含量较野生型相差约30%，过表达株较高、atnfs1突变体较低；HEMA1在突变体下调约30%，HEMA2在过表达株高约40%，GSA1/GSA2在突变体低约30%而过表达株高25–60%，HEMB1/HEMB2在过表达株加倍且HEMB1在突变体低约28%，HEMF2在突变体低55–80%，FC1在过表达株上调2倍、FC2上调25–55%。3.2 AtNFS1表达改变影响过氧化氢酶活性但不影响CAT基因表达（Altered AtNFS1 expression affected catalase activity but not CAT genes expression）：通过总过氧化氢酶活性测定和CAT1/2/3 qRT-PCR发现，过表达株活性高10–15%，突变体低约10%，与血红素含量强相关（R=0.90，P=4.9×10^?4），而CAT转录无显著变化。3.3 Hemin恢复离体线粒体过氧化氢酶活性（Hemin restored catalase activity in isolated mitochondria）：通过离体线粒体加10 μM hemin或原卟啉IX处理发现，hemin几乎完全恢复atnfs1低过氧化氢酶活性，原卟啉IX无显著作用，对照显示外源hemin不显著贡献总活性，提示血红素缺乏而非前体是低活性主要原因。3.4 下调AtFH降低血红素含量和过氧化氢酶活性（Downregulation of AtFH decreased the amount of heme and catalase activity）：通过AtFH反义瞬时转化和qRT-PCR确认AtFH下降且AtNFS1转录不受影响；wt-aFH和AtNFS1-aFH血红素低约35%，atnfs1-aFH双降约60%；过氧化氢酶活性仅AtFH下降时低30%，双降约50%；血红素与过氧化氢酶活性强相关（R=0.89，P=6.1×10^?7）。

讨论总结：铁参与Fe-S蛋白和血红素蛋白生物合成；frataxin在哺乳动物、酵母和植物参与线粒体Fe-S簇生物合成、铁稳态和血红素合成。研究验证植物Fe-S簇与血红素生物合成通路连接，关键为frataxin及其与ISC成员形成的多蛋白复合体。AtFH可能通过供铁等直接催化植物线粒体血红素合成最后一步。AtNFS1表达改变影响血红素含量、ISC基因及血红素合成关键酶转录；HEMA步骤关键，但线粒体组分影响初始步骤的机制待阐明。高/低血红素对应四吡咯通路基因上/下调，原文提出可能涉及血红素调控和叶绿体到核逆行信号；AtFH双定位线粒体和叶绿体可能参与不稳定血红素池（labile heme pool）。过氧化氢酶活性与血红素含量对应而CAT转录不变，hemin恢复而原卟啉IX不恢复，支持血红素可用性影响酶活，但原文指出尚不能确定直接掺入还是其他血红素稳态后果。AtFH下调在AtNFS1背景中叠加，说明AtFH直接参与血红素合成；其活性受与AtNFS1-AtISD11-ACP核心复合体物理互作调节。AtNFS1/AtISD11高表达时血红素和过氧化氢酶活性高，与体外AtFH ferrochelatase活性增强一致。植物FC1/FC2仅定位于质体，原文提出线粒体ferrochelatase活性可能由frataxin执行。

研究结论翻译：综上所述，AtNFS1表达改变的植物表现出血红素生物合成通路多个转录本改变，导致总血红素含量及血红素依赖酶如过氧化氢酶活性变化。atnfs1突变体受损的过氧化氢酶活性可被外源hemin恢复，而不能被无铁前体原卟啉IX恢复。AtFH具有内在ferrochelatase活性，但atnfs1株系因AtFH、AtNFS1和AtISD11水平低，不能有效利用添加的原卟啉IX合成血红素。AtFH与AtNFS1、AtISD11和ACP可形成催化效率更高的复合体。研究人员提出，AtNFS1和AtISD11的存在可提高AtFH的ferrochelatase活性，而AtNFS1缺陷会破坏复合体正确组装，显著降低AtFH效率。AtNFS1和AtFH表达降低对细胞血红素含量和过氧化氢酶活性产生叠加抑制。因此，除已知参与线粒体铁池生物可利用性和驱动Fe-S簇生物合成外，AtFH与AtNFS1-AtISD11-ACP亚复合体可作为拟南芥血红素生成和血红素蛋白活性调节者。