过氧化物酶体乙醇酸氧化酶1和2（GOX1/GOX2）缺失差异影响拟南芥线粒体电子传递链（mETC）及氧化还原状态与镉胁迫响应

《Plant Stress》：The lack of peroxisomal Glycolate Oxidases 1 and 2 influences mitochondrial ETC and its redox state under control and cadmium stress

　　

摘要：镉（cadmium，Cd）诱导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生已被广泛研究，并表明其在植物对该重金属的响应中发挥关键作用。尽管RBOHs等酶的作用已被深入研究，其他产生ROS的酶，例如过氧化物酶体乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase，GOX），其功能仍很大程度上被忽视。过氧化物酶体GOX是发生于叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中的光呼吸（photorespiration）途径的核心代谢酶。研究人员利用缺失主要过氧化物酶体GOX基因GOX1（gox1-1）和GOX2（gox2-1）的拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变体，探讨其植物对Cd响应的功能。尽管在对照和Cd胁迫条件下两个突变体的光合能力似乎受到同等程度影响，GOX2似乎在该金属诱导的ROS产生中发挥更大作用。对野生型（wild type，WT）和gox2-1的转录组分析指向线粒体电子传递链（mitochondrial electron transport chain，mETC）是Cd胁迫的靶标。研究人员进一步研究GOX1和GOX2在mETC调控和氧化还原状态中的各自功能。尽管两个突变体的线粒体氧化比率均较高，但在缺失GOX1时更为明显。此外，两个突变体的mETC均受影响，但其组分调控在各突变体中不同。这些结果指出两个光呼吸GOX同工型在拟南芥中的不同功能，有助于更好地理解光呼吸途径。

镉（cadmium，Cd）污染与农业和环境风险是本研究的重要背景。已有研究表明，Cd即使在低浓度下也具有较高毒性，全球农田重金属污染及Cd超标问题突出；除防控土壤污染外，还需理解Cd对植物的影响并防止其进入食物链。Cd胁迫的重要间接效应之一是活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生：低水平ROS可作为信号分子参与光合效率、抗氧化活性及金属/离子稳态调控，高水平则导致氧化胁迫损伤。尽管质膜NADPH氧化酶RBOHs等来源已被关注，不同细胞区室来源ROS在Cd响应中的贡献仍未阐明。过氧化物酶体（peroxisome）是Cd响应中氧化还原状态变化迅速的细胞器，也是ROS重要来源；其β-氧化、多胺分解代谢、肌氨酸氧化酶、黄嘌呤氧化还原酶、尿酸氧化酶及光呼吸（photorespiration）等均可产生ROS。其中，过氧化物酶体乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase，GOX）催化光呼吸中乙醇酸氧化并产生过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂），是光合C3叶片H₂O₂的重要来源，并参与多种生物与非生物胁迫响应；在Cd处理下，多种植物中GOX活性升高。拟南芥基因组有5个GOX基因，GOX1和GOX2是叶过氧化物酶体主要同工型，二者串联重复且单个gox1、gox2突变体GOX活性下降但无明显表型，提示功能冗余；然而gox1而非gox2可减弱cat2突变体光呼吸表型，提示二者可能具有不同代谢作用。基于此，研究人员利用gox1-1和gox2-1突变体，结合生理、生化与转录组方法，解析GOX依赖的Cd响应，重点关注mETC和线粒体氧化还原状态，以明确GOX1/GOX2在Cd胁迫及对照条件下的差异功能及其在光呼吸途径中的作用。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究以Columbia背景WT、gox1-1（SAIL_177_G11）和gox2-1（SALK_044052）为材料，突变体来自Nottingham Arabidopsis Stock Centre（NASC）；线粒体靶向GRX1-roGFP2由Dr A.J. Meyer提供并用于gox背景。采用Cd处理30 min与24 h时间点；测定H₂O₂、GOX与过氧化氢酶（catalase，CAT）活性及光系统II（photosystem II，PSII）最大效率Fv'/Fm'；对WT和gox2进行转录组分析（GSE199325），并行GO富集、ROSMETER、MapMan和qRT-PCR；以Seahorse XFe24测定耗氧率（oxygen consumption rate，OCR），结合SHAM、鱼藤酮和KCN解析交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）、复合体I和复合体IV贡献；用线粒体GRX1-roGFP2测定氧化还原状态。

研究结果如下。1. GOX参与拟南芥Cd处理后ROS产生：通过荧光法定量H₂O₂、测定GOX/CAT活性及基因表达发现，Cd处理30 min仅引起WT中H₂O₂轻微且不显著升高，24 h显著升高；WT的GOX活性24 h显著升高，gox1中仍显著升高而gox2中不升高，GOX2转录本24 h显著升高而GOX1不变；gox2中GOX1无补偿性变化，gox1中GOX2略升高；gox1和gox2残余GOX活性分别约为WT的53%和65%；两个gox突变体24 h Cd后H₂O₂均不升高；CAT活性仅在gox1中显著升高；Cd下各株系PSII最大效率随时间下降，且两个突变体在对照和Cd下均显著低于WT。2. Cd依赖性转录组足迹与不同ROS特征相关：利用ROSMETER分析发现，Cd 30 min转录组变化与鱼藤酮处理（影响线粒体复合体I）、flu突变体（叶绿体单线态氧相关）及臭氧处理（质外体ROS/RBOHs相关）相关性最高，并与反义AOX1和CAT缺陷突变体呈高负相关；24 h仍与鱼藤酮和flu相关，并增加与过氧化物酶体、H₂O₂及胞质氧化胁迫特征的相关性。3. Cd早期植物响应中的GOX2依赖性基因：30 min Cd后WT约500个转录本显著调控，约75%上调；gox2约800个，上下调相近；WT调控而gox2不调控的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）为463个，称GOX2依赖性基因；富集于缺氧、脂肪酸及植物型细胞壁修饰等生物学过程，分子功能富集双加氧酶、转氨酶和转移酶活性，细胞组分主要涉及CCR4-NOT核心复合体和质膜。4. Cd后期植物响应中的GOX2依赖性基因：24 h Cd后WT约950个转录本显著调控，约60%上调；gox2约1500个；WT调控而gox2不调控的DEGs约840个，约占90%，称晚期GOX2依赖性基因；富集于毒素代谢、次生代谢物合成、谷胱甘肽代谢及线粒体-核信号等过程，分子功能富集NADH脱氢酶、氧化还原酶和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）等。5. GOX2与Cd依赖性ROS和氧化还原代谢相关基因：深入分析显示，30 min富集“超氧阴离子自由基清除及其调控”、GST活性和代谢过程，24 h富集GST活性和代谢过程；这些类别中基因多被诱导，仅超氧阴离子自由基清除调控基因被抑制。6. Cd处理触发GOX依赖的线粒体ETC调控：GOX2依赖性DEGs在24 h的主要细胞组分为线粒体；多数线粒体DEGs被诱导，复合体I受影响最大、复合体IV次之，AOX1也上调；qRT-PCR验证WT中这些基因24 h上调而gox2中不上调；gox2对照下AOX1、COX3和CyB较WT上调；早期仅CyB在WT响应中下调；gox1中多数 analyzed 基因在对照下较WT上调、Cd后下降或不变，NAD5表现类似WT。7. Cd处理影响线粒体呼吸并受GOX调控：OCR及抑制剂解析显示，WT在Cd下线粒体呼吸较对照增加逾2倍，复合体I似受抑制，增加可能由复合体IV和AOX1诱导所致；gox1和gox2对照下呼吸率分别约为WT的2.3倍和2.7倍，但Cd未引起突变体显著诱导；gox1对照增加主要归因于AOX活性，Cd下主要归因于复合体I和AOX；gox2对照增加主要归因于复合体I、较少归因于AOX，Cd下AOX贡献为主且复合体I受抑制。8. 光呼吸GOX影响线粒体氧化还原状态：利用线粒体GRX1-roGFP2发现，WT在Cd 24 h后线粒体氧化状态无显著变化；gox1和gox2在对照下405/488 nm荧光比均高于WT，gox1受影响更明显；Cd下突变体较其对照无显著变化，但仍显著高于WT。

讨论部分总结：讨论指出，GOX2在gox1中表达诱导而GOX1在gox2中不变，显示两同工型间非对称转录补偿，提示GOX1与GOX2并非功能等同；结合既往证据，GOX1是光呼吸H₂O₂产生的主要贡献者，GOX2可能在某些条件下部分补偿GOX1缺失。gox1和gox2在对照下即表现线粒体氧化增加和基础呼吸升高，说明GOX依赖调控在无胁迫时也参与线粒体稳态；GOX活性降低可改变乙醇酸代谢、碳分配和氨基酸稳态，线粒体光呼吸代谢本身受硫氧还蛋白依赖的氧化还原调控，GOX扰动可间接影响线粒体还原力和呼吸电子供应。GOX2在Cd响应转录程序中作用突出：WT中约90% Cd响应基因在gox2中响应受损，涉及mETC、抗氧化代谢和解毒；对照下gox2中唯一转录改变的呼吸途径为替代呼吸，支持其呼吸表型。Cd下WT呼吸增加并伴随ETC组分和AOX转录诱导，而gox1和gox2响应失调，说明GOX依赖过程参与Cd胁迫下线粒体驯化机制；复合体I、AOX和复合体IV的差异行为支持光呼吸代谢参与氧化胁迫下线粒体呼吸柔性调控。WT在Cd下线粒体氧化还原状态基本不变，而突变体在对照和Cd下均呈组成性氧化升高，提示GOX依赖途径主要参与基础线粒体氧化还原稳态建立与维持，而非仅在胁迫时起作用；WT未进一步氧化可能反映GST途径和线粒体-核信号等解毒机制激活。GOX缺失对线粒体氧化还原、呼吸和转录组的协同影响支持过氧化物酶体-线粒体信号轴，光呼吸H₂O₂作为区室特异性信号分子发挥作用。研究结论翻译：综上，研究人员提出GOX1和GOX2对协调光呼吸代谢、线粒体功能和胁迫响应具有不同贡献；gox1中GOX2表达诱导及既往GOX1为主要光呼吸H₂O₂贡献者的证据提示，GOX2可能在某些条件下部分补偿GOX1缺失；但gox1和gox2均表现线粒体氧化增加和基础呼吸升高，表明两同工型在非胁迫条件下均参与线粒体稳态维持；此外，gox2中Cd响应基因表达明显受损，提示GOX2在胁迫相关信号和转录调控中尤为重要；因此，GOX1和GOX2并非严格冗余酶，而是差异整合光呼吸代谢、氧化还原稳态和Cd胁迫适应；这些发现重新定义光呼吸为氧化还原交流的主动参与者而非附带代谢途径，并突出过氧化物酶体-线粒体界面为细胞氧化还原稳态的关键调控枢纽。