肠道共生Lactobacillus johnsonii经LdhA–ILA–IPA–AhR/YAP轴重塑肠–卵巢轴并缓解卵巢衰老

《iMetaOmics》：Lactobacillus johnsonii attenuates ovarian aging by remodeling the gut–ovary axis

　　

生殖衰老（reproductive aging）伴随性激素水平异常，影响整体健康，并对女性构成特别威胁。肠道菌群（gut microbiota）在调节宿主衰老中发挥关键作用，并有望缓解生殖衰老。在本研究中，研究人员发现肠道共生菌Lactobacillus johnsonii（L. johnsonii）在雌性衰老小鼠中随卵巢功能衰竭（ovarian failure）而下降。恢复L. johnsonii可部分挽救年龄诱导或化学诱导的卵巢衰退小鼠模型的激素水平，从而逆转认知衰退并延长寿命。L. johnsonii的生物活性代谢物吲哚-3-丙酸（indole-3-propionic acid, IPA）通过激活AhR-YAP信号通路（AhR-YAP signaling pathway）促进颗粒细胞（granulosa cells）增殖，上调性类固醇输出（sex-steroid output）。L. johnsonii来源的LdhA被鉴定为吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid, ILA）生物合成的关键酶，从而提高下游IPA。此外，卵巢功能与粪便（fecal）L. johnsonii及IPA水平呈显著正相关。这些发现确立L. johnsonii作为一种有前景的益生菌策略，通过沿肠–卵巢轴（gut–ovary axis）的微生物群衍生代谢物信号缓解卵巢衰老。

研究背景与意义：生殖衰老是全身衰老的加速器，包括生理性卵巢衰老和由内外因素导致的病理性卵巢衰退；前者为卵巢功能自然衰退并最终进入绝经，后者为异常下降。卵巢衰老导致女性生育力下降，并与骨质疏松、心血管疾病和认知衰退等激素相关疾病相关。激素治疗是主要临床手段，但长期补充的依从性受潜在副作用担忧影响，因此需要探索更安全、依从性更好的缓解策略。卵巢衰老机制复杂，涉及线粒体功能障碍、表观遗传紊乱、慢性炎症微环境和干细胞耗竭；肠道菌群作为宿主生理和衰老的关键外源性调节者，通过产生代谢物进入系统循环，介导肠道与远隔器官的串扰。已有研究显示年轻小鼠粪菌移植可改善老年小鼠生殖衰退，Eggerthella高丰度可诱导卵巢衰退，微生物相关代谢物亚精胺（spermidine）可保护卵母细胞，IPA可促进神经再生、减轻辐射毒性并改善动脉粥样硬化。基于此，研究人员观察到自然衰老雌性小鼠粪便L. johnsonii随卵巢衰竭下降，并开展补充L. johnsonii在自然衰老和环磷酰胺（cyclophosphamide, Cy）诱导卵巢衰退模型中的作用及机制研究，提出L. johnsonii通过LdhA-ILA-IPA-AhR-YAP轴缓解卵巢衰老，并延长健康寿命和寿命，人队列支持其临床相关性。其意义在于建立肠–卵巢轴机制并识别益生菌策略。

关键技术方法：采用16S rRNA测序比较4月龄与20月龄雌性小鼠粪菌并计算微生物失调指数（microbial dysbiosis index, MDI），以qPCR定量粪便L. johnsonii；使用自然衰老、Cy诱导卵巢衰退、Zmpste24^?/?早衰、去卵巢（ovariectomy, OVX）及无菌小鼠定植模型；用靶向/非靶向LC-MS/MS检测血浆、卵巢和粪便色氨酸代谢物；在KGN细胞中开展增殖/凋亡、RNA测序（RNA-seq）、Western blot和免疫荧光；以分子对接和表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）分析IPA与AhR结合；人粪便样本来自健康促进中心20–40岁与40–50岁女性队列；小鼠来源包括Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd.、Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.、GemPharmatech Co. Ltd.及赠送的Zmpste24^?/?小鼠。

研究结果：1）L. johnsonii improves ovarian function in aging female mice。通过16S rRNA测序比较4月龄与20月龄雌性小鼠粪菌，发现衰老雌鼠微生物多样性改变、MDI升高、L. johnsonii显著减少；在自然衰老雌鼠补充L. johnsonii可提高相对卵巢重量和血浆雌二醇（E₂）、降低卵泡刺激素（FSH）、减少闭锁卵泡并维持腔前和窦卵泡数量，对原始卵泡无显著影响；Zmpste24^?/?雌鼠补充4个月使中位寿命延长12.09%，并验证定植。体外和OVX实验表明L. johnsonii不能从头合成雌激素，也不提高OVX循环雌二醇，提示其至少部分通过直接调节卵巢功能发挥作用。

2）L. johnsonii improves ovarian function and fertility in Cy-induced ovarian decline mice。在Cy诱导卵巢衰退模型中，L. johnsonii提高相对卵巢重量，降低FSH、提高E₂和抗苗勒管激素（AMH），挽救原始、腔前和窦卵泡丢失并减少闭锁卵泡；与未处理育龄雄鼠交配后，补充组每窝仔数恢复，4个月观察中出生次数一定程度改善但无显著差异，提示生育力受损可被部分挽救。

3）Microbiota-derived ILA and IPA improve ovarian function in Cy-induced ovarian decline mice。L. johnsonii促进Lactobacillus和Akkermansia等有益菌定植；无色氨酸饮食中L. johnsonii不能恢复卵巢重量和激素；L. johnsonii提高血浆吲哚-3-丙酮酸（IPYA）、ILA、IPA并降低吲哚-3-丙烯酸（IA）；只有ILA和IPA在卵巢组织可检测，IPA显著升高；补充ILA或IPA均提高相对卵巢重量，ILA降低FSH但E₂和AMH无显著差异，IPA改善三种激素；两者增加原始、腔前和窦卵泡，IPA减少闭锁卵泡；每日L. johnsonii维持血浆ILA和IPA稳定。结论为微生物来源ILA和IPA，尤其IPA改善卵巢功能。

4）LdhA is the key enzyme for L. johnsonii to attenuate ovarian decline。无菌小鼠单/共定植显示L. johnsonii单独产生ILA，IPA需要C. sporogenes共定植；比较多种肠道共生菌，L. johnsonii的ILA产量最高；基因组分析显示ldhA编码关键酶；因L. johnsonii遗传修饰困难，异源表达ldhA于E. coli，E. coli-ldhA可利用IPYA产ILA，提高Cy模型血浆和卵巢IPA，口服减轻卵巢损伤。结论为LdhA是L. johnsonii缓解卵巢衰退的关键酶，微生物来源色氨酸衍生物可缓解卵巢衰退。

5）IPA enhances granulosa cell proliferation via the regulation of AhR/YAP。KGN细胞中ILA和IPA剂量依赖性促增殖，IPA更强且仅IPA减少凋亡；RNA-seq显示IPA改变CTGF和CYR61表达，qPCR和Western blot证实YAP1、YAP、CTGF和CYR61升高；体内免疫荧光显示IPA或L. johnsonii增强YAP、CTGF和CYR61信号，细胞免疫荧光显示IPA促进YAP核积累；YAP抑制剂verteporfin（VP）阻断IPA体外促增殖和体内改善卵巢重量及激素；AhR抑制剂StemRegenin 1（SR1）减弱IPA促增殖并抑制YAP通路；JASPAR预测YAP1启动子AhR结合基序；分子对接和SPR显示IPA与AhR chain D结构域结合，解离常数（K_D）为224 μM。结论为IPA可能通过AhR/YAP轴依赖方式促进颗粒细胞增殖。

6）L. johnsonii improves healthspan in aging female mice and humans。自然衰老雌鼠补充L. johnsonii逆转雌激素缺乏相关认知衰退（新物体识别和Y迷宫），OVX小鼠中该保护作用消失，提示卵巢功能恢复是认知保护所需；人队列显示40–50岁女性粪便L. johnsonii和IPA低于20–40岁，L. johnsonii和IPA与年龄负相关，IPA与L. johnsonii正相关，粪便L. johnsonii或IPA与窦卵泡计数（antral follicle count, AFC）显著正相关。结论支持肠–卵巢轴的临床相关性。

讨论部分总结：讨论指出L. johnsonii是婴儿肠道主要乳杆菌之一，常见定植于成人肠道，通过调节氧化应激、炎症和免疫维持皮肤和肠道稳态；卵巢衰老复杂且缺乏有效干预。本研究体内外证明L. johnsonii可能通过色氨酸代谢物IPA调节卵巢功能；既往白藜芦醇（resveratrol）研究显示其通过逆转微生物相关色氨酸-犬尿氨酸通路改善卵巢氧化应激，本研究补充L. johnsonii富集Akkermansia等“有益”细菌并调节肠–卵巢轴色氨酸代谢，与既往动物实验和临床试验一致。近期研究显示色氨酸来源IPA通过抗氧化和抗炎机制改善Epirubicin诱导卵巢损伤并稳定血清激素；本研究采用衰老和化学诱导两种模型，并阐明IPA经AhR/YAP促进颗粒细胞增殖。人队列横断面显示40–50岁女性粪便L. johnsonii和IPA低于20–40岁，且与AFC正相关；但横断面研究年龄是重要混杂因素，不能推断独立因果效应，未来需年龄匹配队列或干预研究验证转化相关性。与直接补充IPA相比，补充产IPA细菌更合适，可重现内源性肠道微生物IPA产生并维持生理性肠–卵巢信号轴。讨论还指出IPA可能通过YAP通路促进颗粒细胞增殖，YAP/TAZ-TEAD复合物是KGN细胞类固醇合成酶基因的新转录调节因子，CTGF和CYR61与卵母细胞质量及卵泡发育和颗粒细胞增殖相关；AhR是肠道菌群来源IPA抗炎作用的关键介质，AhR抑制剂限制IPA对YAP的作用；分子对接和SPR证实IPA与AhR直接互作；尽管体内血浆浓度低于体外实验浓度，但灌胃L. johnsonii可提高IPA至产生保护作用的水平，IPA在卵巢内的详细药代动力学仍待研究。

研究结论翻译：总之，本研究证明L. johnsonii通过稳定定植于肠道生态位，作为ILA的关键来源，ILA进一步代谢为IPA。这种微生物群衍生的IPA作为系统性类内分泌信号，经循环到达并激活卵巢内AhR-YAP通路，从而连接肠–卵巢轴。研究结果建立对肠–卵巢轴机制的理解，并将L. johnsonii确定为有前景的益生菌治疗策略。