《Plant Physiology and Biochemistry》：The transcription factor MsMYB28 enhances drought tolerance in alfalfa through antioxidant defense and transcriptional regulation of stress responsive pathways
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转录因子MsMYB28被鉴定为紫花苜蓿干旱耐受性的正调控因子。MsMYB28通过提高抗氧化能力和渗透调节来增强干旱耐受性。MsMYB28调控涉及ABA信号传导、LEA基因和类黄酮生物合成的干旱响应网络。
转录因子MsMYB28被鉴定为紫花苜蓿干旱耐受性的正调控因子。MsMYB28通过提高抗氧化能力和渗透调节来增强干旱耐受性。MsMYB28调控涉及ABA信号传导、LEA基因和类黄酮生物合成的干旱响应网络。
**MsMYB28调控紫花苜蓿干旱耐受性的分子机制解读**
**1. 研究背景与科学问题**
水资源缺乏是制约植物生存的关键因素，干旱胁迫通过扰乱关键生理过程导致作物产量严重下降，过去十年全球因干旱造成的农业损失估计约300亿美元。到2050年，农业用水需求预计翻倍，而淡水供应将减少一半，全球近50亿人将面临水资源短缺。紫花苜蓿（*Medicago sativa* L.）作为全球重要的多年生豆科牧草，被誉为“牧草之王”，但其生长和产量受到干旱、高盐等非生物胁迫的严重制约。干旱首先造成水分亏缺，降低叶片相对含水量和气孔导度，限制CO?同化和光合作用；同时，活性氧（ROS）过度积累和抗氧化系统失衡导致脂质过氧化、蛋白质降解和膜损伤。植物已进化出复杂的形态、生理、生化和分子适应系统来应对干旱。MYB转录因子家族在植物生长发育、次生代谢及胁迫响应中发挥关键调控作用。尽管已在紫花苜蓿中鉴定出265个MsMYB基因，但大多数成员的功能尚不清楚，单个MsMYB成员参与干旱适应的机制仍 largely unknown。因此，系统鉴定和表征干旱响应关键MYB基因的功能，对解析紫花苜蓿抗旱分子机制及抗逆育种具有重要意义。
**2. 研究内容与主要结论**
该研究以紫花苜蓿品种‘中苜1号’为材料，通过全基因组鉴定获得229个MsMYB转录因子，并筛选出23个与已知抗逆MYB基因紧密相关的候选基因。其中，MsMYB28在PEG模拟干旱处理6小时时表达量较0小时升高534倍，且呈现根组织优先表达模式，被确定为核心候选基因。研究人员通过农杆菌介导的叶盘法获得了MsMYB28过表达（OE）和RNA干扰（Ri）转基因紫花苜蓿株系，结合表型、生理生化分析及转录组测序，系统揭示了MsMYB28调控干旱耐受性的分子机制。结果表明，MsMYB28正调控紫花苜蓿干旱耐受性：过表达MsMYB28显著提高植株在严重水分亏缺下的存活率、相对含水量和株高，增强抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性和脯氨酸积累，降低电解质渗漏率和丙二醛含量，减少ROS积累；同时维持更高的光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）和有效量子产量（Y(II)），增强叶片保水能力。转录组分析显示，MsMYB28过表达加速并维持了ABA信号传导、渗透调节、抗氧化防御及次生代谢（苯丙烷和类黄酮生物合成）等通路相关基因的协同激活，而RNAi株系则表现延迟或减弱。该研究首次系统阐明了MsMYB28通过整合ABA信号感知与多条抗氧化途径赋予紫花苜蓿干旱耐受性的分子网络，为牧草抗逆遗传改良提供了重要基因资源和理论依据。
**3. 主要关键技术方法**
研究人员利用HMM谱搜索和保守结构域验证在全基因组水平鉴定MsMYB基因家族；通过系统发育分析、启动子顺式作用元件预测和qRT-PCR筛选干旱响应候选基因。采用亚细胞定位实验（35S::MsMYB28-eGFP在本氏烟叶片瞬时表达）确认MsMYB28定位于细胞核。通过农杆菌介导的叶盘法在‘中苜1号’中创制OE和Ri转基因株系，并进行干旱处理下的表型与生理指标测定（包括ROS组织化学染色和叶绿素荧光成像）。RNA-seq分析采用15% PEG-6000模拟渗透胁迫，对OE（OE-1和OE-6混合）和Ri（Ri-8和Ri-10混合）及野生型在0、6、24小时根组织进行转录组测序（数据已提交NCBI SRA，登录号PRJNA1415877），结合GO和KEGG富集分析解析差异表达基因功能。
**4. 研究结果分述**
（1）**紫花苜蓿MsMYB家族的全基因组鉴定**：通过HMM搜索从紫花苜蓿基因组中鉴定出229个MsMYB基因（MsMYB1-MsMYB229），系统发育分为四组，其中Class I包含所有已知其他物种的胁迫响应MYB基因。蛋白质理化性质分析显示其长度、分子量、等电点差异显著，大多为亲水性蛋白。染色体定位发现MsMYB基因不均匀分布于8条染色体和2个未锚定contig，Chr1基因密度最高。共线性分析表明片段重复是家族扩张主要驱动力，Ka/Ks比值均小于1说明纯化选择主导进化。
（2）**干旱响应MsMYB基因的生物信息学与表达特征**：基于同源筛选获得23个候选基因，可系统发育分为三个亚家族。组织表达分析显示MsMYB28、MsMYB105和MsMYB217在根或根瘤中高表达。甘露醇和ABA处理诱导多数基因差异表达，且启动子区显著富集MBS和ABRE元件，表明这些基因参与ABA依赖和/或不依赖的干旱信号通路。
（3）**核心候选基因MsMYB28的表达特征与序列保守性**：qRT-PCR证实MsMYB28在PEG处理6小时表达量激增534倍，具有根优先表达特性。系统发育显示其与蒺藜苜蓿MtMYB61紧密聚类，属于R2R3-MYB亚家族，包含高度保守的R2和R3结构域，是典型的干旱响应核心调控基因。
（4）**MsMYB28基因的抗旱性分析与分子特征**：亚细胞定位实验证明MsMYB28-eGFP融合蛋白定位于细胞核。染色体定位显示MsMYB28位于第1号染色体，编码典型R2R3-MYB转录因子。在‘中苜1号’中获得OE和Ri株系，其中OE-1、OE-6和Ri-8、Ri-10被选为代表性株系进行后续实验。
（5）**干旱胁迫下表型及水分状态变化**：干旱18天后，Ri株系叶片卷曲萎蔫严重，WT中度敏感，OE株系叶片保持绿色健康；复水后OE大多恢复，Ri无法恢复。OE株系的相对含水量和株高显著高于WT，WT高于Ri。CAT、SOD、POD活性和脯氨酸含量在OE中最高、WT居中、Ri最低；而相对电导率、MDA含量趋势相反。NBT和DAB染色显示Ri积累最多ROS，OE最少，证明MsMYB28通过增强抗氧化能力和渗透调节减轻氧化损伤。
（6）**MsMYB28调控干旱下叶绿素荧光参数的变化**：离体叶片脱水处理后，OE株系在12和24小时维持更高的Fv/Fm和Y(II)值，并表现出更高的qP和NPQ能力，表明MsMYB28保护光合装置免受脱水损伤。叶片失水速率检测显示OE株系失水最慢，Ri最快，说明MsMYB28增强叶片保水能力。
（7）**WT、OE和RNAi株系干旱胁迫下的差异转录组分析**：转录组测序显示，干旱24小时时OE株系产生大量特有DEGs。GO富集分析表明MsMYB28调节水分剥夺、渗透胁迫、氧化胁迫及ABA相关过程；6小时早期应激反应和ABA过程快速激活，24小时富集渗透调节、持续ABA信号和海藻糖代谢。KEGG富集分析显示6小时主要富集植物激素信号转导、MAPK信号通路、过氧化物酶体和谷胱甘肽代谢，24小时富集碳代谢、糖酵解/糖异生、TCA循环、精氨酸和脯氨酸代谢及苯丙烷和类黄酮生物合成。核心候选基因热图分析显示，OE株系中ABA受体基因PYL4/9、蛋白激酶SnRK2.6、胁迫响应蛋白ABR17，以及GST、CAT2、LEA基因和类黄酮合成相关基因CHI、DFR、PAL均显著上调。qRT-PCR验证了十多个代表性DEGs的诱导表达模式，并在自然土壤干旱条件下得到部分验证，证实了关键通路在长期干旱中的关联性。
**5. 讨论总结**
研究人员在讨论中指出，MYB转录因子广泛参与植物胁迫响应，而MsMYB28具有根优先表达特性，可能通过根-冠通讯信号（如ABA、ROS/Ca2?波或移动肽）影响地上部生理响应，但具体机制尚需直接证据。MsMYB28过表达通过增强酶促抗氧化系统（SOD、POD、CAT）和非酶促抗氧化物质（类黄酮、脯氨酸）协同清除ROS，同时维持光合性能，这与已报道的MsMYBH和MsMYB2L功能有共通之处但也有差异。转录组证据显示MsMYB28上调ABA受体PYL4/9和激酶SnRK2.6基因，提示其可能通过ABA相关途径调控下游胁迫响应基因，但因未直接测定内源ABA水平、气孔动力学和ABA敏感性，尚不能确定MsMYB28直接增强ABA信号或调控气孔响应。参与苯丙烷和类黄酮生物合成的关键酶基因上调也强化了抗氧化网络，为极端干旱下生存提供分子基础。
**6. 研究结论**
该研究鉴定出MsMYB28是紫花苜蓿干旱耐受性的正调控因子。过表达MsMYB28通过增强生理适应（改善保水能力、维持光合活性、强化抗氧化防御）提高干旱表现。转录组分析表明MsMYB28介导的干旱耐受性与ABA响应基因、渗透调节相关基因及胁迫响应代谢通路的表达变化相关联。此外，包括ROS清除和渗透调节相关的多个抗氧化和保护基因在MsMYB28调控下表达模式改变。总体而言，这些发现证明MsMYB28通过协调多条胁迫响应过程促进紫花苜蓿干旱耐受性，并为改善牧草作物抗旱性提供了潜在基因资源。
