基于N6培养基的藜麦高效再生体系建立及其基因组稳定性与碳氮代谢重编程机制研究

《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome Stability and Carbon–Nitrogen Metabolic Reprogramming Are Associated with Regeneration Competence in Quinoa

　　

： 基于N6培养基并添加6-BA和NAA的配方可高效诱导藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）不定芽再生。倍性稳定性与藜麦再生能力密切相关。藜麦再生过程涉及碳-氮代谢重编程。再生藜麦植株中必需氨基酸含量显著升高。

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一、研究背景与科学问题

全球气候变化与粮食安全需求日益迫切，促使研究人员不断发掘兼具逆境耐受性和高营养价值的作物。藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）因其氨基酸组成均衡、矿物质积累丰富且天然无麸质，被广泛视为"超级食物"。同时，藜麦强大的逆境适应能力使其成为遗传改良和代谢调控研究的理想材料。现代藜麦育种正从传统以产量和抗逆为目标，逐步转向营养品质的定向改良，如提高蛋白质含量和降低皂苷积累。

CRISPR/Cas、TILLING和RNA干扰（RNAi）等新型育种技术为植物遗传改良提供了新机遇，然而这些技术在藜麦中的应用受到一个关键瓶颈的严重制约：缺乏高效稳定的离体再生体系，这限制了藜麦遗传转化和分子育种研究的推进。

以往藜麦离体再生研究多基于常规MS或改良MS基础培养基，虽在不同植物生长调节剂组合（如2,4-D和6-BA）下探索出不同程度的再生效果，但再生效率不一致且常呈现基因型依赖性。值得注意的是，N6基础培养基在玉米、大麦等禾谷类作物中比MS培养基更能有效诱导愈伤组织，也成功应用于苹果的直接不定芽诱导（再生率达81.8%），但N6培养基在藜麦直接器官发生中的潜力尚未被探索。鉴于藜麦与烟草的系统发育距离较远，评估N6作为替代基础培养基是提高藜麦再生效率的一条合理且有前景的途径。

此外，阐明体细胞重编程和分生组织重建的分子机制对于确保一致的再生结果至关重要。在拟南芥等模式植物中的研究已揭示生长素-细胞分裂素串扰通过特定分子机制调控离体器官从头再生，包括ARF3介导的细胞分裂素生物合成调控。然而，藜麦中哪些调控网络在起作用、这些网络如何影响离体培养过程中的基因组稳定性和转录重编程，仍不清楚。

更重要的是，为营养育种设计的再生方案不仅要高效产生植株，还必须维持再生植株的高营养价值。组织培养研究中常忽视维持再生植物稳定的营养品质，而这对于生物技术在功能食品开发中的实际应用至关重要。迄今为止，很少有研究系统分析再生藜麦的代谢特征，导致再生能力差异的细胞学基础也尚不明确。

二、研究目的与总体设计

本研究旨在实现三个主要目标：第一，建立稳定高效的藜麦再生体系；第二，通过细胞学和转录组学检测阐明再生性能差异的调控机制；第三，通过靶向代谢组学表征再生植株的代谢变异。通过整合细胞学、转录组学和代谢组学方法，该研究力求提供对藜麦再生的机制性理解，并为未来遗传改良和功能食品开发提供实用平台。

三、主要关键技术方法

研究人员以藜麦品种LC01为实验材料，该品种由上海市农业科学院中国（上海）国际藜麦创新中心提供，是上海地区主栽品种之一，被选为体系建立的代表性基因型。种子经次氯酸钠溶液表面消毒后接种于1/2 MS发芽培养基，7天后记录发芽率。取生长良好的顶芽分别接种于两种诱导培养基：诱导培养基1为N6基础培养基（含6 g/L琼脂、30 g/L麦芽糖、200 mg/L脯氨酸、400 mg/L谷氨酰胺、100 mg/L水解酪蛋白）添加0.1 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA；诱导培养基2为相同N6基础成分添加0.5 mg/L KT和1.0 mg/L 2,4-D。培养42天后统计丛生芽和愈伤组织的诱导率。

关键技术方法包括：流式细胞术（flow cytometry）用于检测核倍性变异，以腋芽和成熟叶为对照；RNA测序（RNA-seq）在Illumina HiSeq X Ten平台进行，clean reads比对至藜麦参考基因组（NCBI Assembly: ASM168347v1），差异表达基因（DEGs）鉴定阈值为校正P < 0.05且|log?FC| > 1；RT-qPCR用于验证RNA-seq结果，以TUB1为内参基因；可溶性糖采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）测定，游离氨基酸采用超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱（UPLC–Q-Orbitrap MS）定量。所有实验设三次独立生物学重复，RNA-seq设四次生物学重复（每次由三株植物混合）。

四、研究结果

4.1 丛生芽和愈伤组织的诱导与再生

培养7天后，藜麦种子发芽率达96.05%，子叶完全展开。在诱导培养基1上，顶芽从子叶处长出多片幼叶，丛生芽诱导率达93.50%。健康丛生芽转至分化培养基继代培养，增殖系数为1.95倍，再生植株平均高度2.44 cm。在诱导培养基2上，下胚轴处观察到愈伤组织膨大，20天后形成颗粒状愈伤组织，诱导率达79.03%，但子叶逐渐变黄并被缓慢增殖的愈伤组织覆盖。愈伤组织继代增殖系数仅1.2倍。继代愈伤组织转至分化培养基后，颜色由浅棕变深棕，仅小部分变绿，未观察到可再生的胚性愈伤组织，最终愈伤组织未能再分化，未获得完整再生植株。

4.2 流式细胞术分析丛生芽和愈伤组织

研究人员以腋芽（具分化能力的分生组织）和成熟叶（无再生潜力的分化组织）为对照。腋芽直方图中单倍体（1C）峰出现在FL2A值约49,000处，4C峰（异源四倍体藜麦正常体细胞DNA含量，2n = 4x = 36）约101,000处，变异系数接近5%。成熟叶组织4C峰约92,000，8C峰约191,000。丛生芽的DNA直方图与对照腋芽一致，显示稳定的1C和4C峰，表明丛生芽具有稳定的基因组互补状态（正常异源四倍体状态）。而愈伤组织样本与对照组织差异显著：缺乏分生组织区域a和b，仅检测到倍性相关区域c和细胞碎片区域d。愈伤组织直方图呈现4C、8C和16C峰，以及额外的非整数C值峰，表明发生了内复制、多倍化和与可能非整倍体一致的倍性异常。这些观察表明倍性稳定性与再生能力之间存在关联，但当前数据无法区分基因组稳定性是再生的原因还是结果。

4.3 丛生芽、黄色愈伤组织和再生幼苗的转录组图谱

主成分分析（PCA）显示样本间存在显著转录组差异，PC1占总变异的86.11%，清晰分离再生幼苗与黄色愈伤组织和丛生芽；PC2解释13.4%的方差，进一步区分黄色愈伤组织与丛生芽。火山图鉴定出黄色愈伤组织与丛生芽之间8,537个DEGs（4,762个上调，3,775个下调）；丛生芽与再生幼苗之间11,015个DEGs（6,354个上调，4,661个下调）。DEGs层次聚类显示生物学重复清晰分组，证实转录组数据可靠且不同表型具有独特的转录谱。

4.4 差异表达基因的功能富集分析

基因本体（GO）富集分析显示，丛生芽中相对于黄色愈伤组织上调的基因显著富集于防御反应等应激反应和转录重编程通路，下调基因主要富集于细胞壁生物发生、胞外区和血红素结合等正常发育和结构完整性相关条目。转录因子筛选发现两个DOF基因（LOC110695368和LOC110682108）在丛生芽中分别上调9.46倍和5.04倍，一个WRKY基因（LOC110682067）上调超过9倍。

KEGG通路分析显示，丛生芽相对于黄色愈伤组织上调基因显著富集于淀粉和蔗糖代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、光合作用-天线蛋白、脂肪酸延长和油菜素内酯生物合成等通路；下调转录本主要富集于苯丙烷生物合成、谷胱甘肽代谢、玉米素生物合成、角质/软木脂和蜡质生物合成以及甜菜红素生物合成。再生幼苗中上调基因富集于光合作用和卟啉代谢，与自养建立一致，而下调基因涉及次生代谢和信号转导。

4.5 淀粉和蔗糖代谢关键通路

将DEGs映射至该网络（ko00500）揭示编码关键分解代谢酶的基因协调上调。在淀粉降解分支中，α-淀粉酶（AMY1；EC 3.2.1.1）和α-葡萄糖苷酶（AGL1；EC 3.2.1.20）转录激活。蔗糖动员与转化酶（INV1；EC 3.2.1.26）和蔗糖合酶（SUS2；EC 2.4.1.13）上调相关。释放的单糖预计被下调的己糖激酶（HXK1和HXK2；EC 2.7.1.1）磷酸化，产生葡萄糖-6-磷酸（G6P）和果糖-6-磷酸（F6P）。RT-qPCR验证结果与转录组谱一致，α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖合酶和磷酸葡萄糖变位酶显著上调，而己糖激酶（HXK1和HXK2）在丛生芽中相对于黄色愈伤组织显著下调，RNA-seq与qRT-PCR数据相关系数R2 = 0.9348。

4.6 再生幼苗的靶向代谢组学分析

与同期叶龄的对照幼苗相比，再生幼苗中D-甘露糖含量显著升高，棉子糖无显著变化，而蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖含量显著降低。氨基酸方面，多种氨基酸含量显著升高，包括必需氨基酸如L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸和L-组氨酸；关键代谢节点如谷氨酸、天冬氨酸和L-天冬酰胺；以及L-精氨酸、L-瓜氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、L-4-羟脯氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸和D-2-氨基丁酸等。同时，L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-胱氨酸含量显著降低。热图分析显示再生叶片与对照幼苗之间具有明显不同的代谢谱。

五、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出该研究建立了基于N6基础培养基的高效丛生芽再生体系，6-BA与NAA的组合有效诱导了旺盛的丛生芽形成，而KT与2,4-D的组合导致不可再生的愈伤组织增殖。值得注意的是，本研究中6-BA和NAA浓度（分别为0.1 mg/L和1.0 mg/L）是先前藜麦再生研究报道浓度的一半，但较低的激素投入结合N6基础培养基实现了更高效的丛生芽形成，表明N6培养基可能为藜麦再生提供了更适宜的营养环境。低浓度6-BA/NAA组合的成功可能反映了经典的生长素与细胞分裂素比例调控芽器官发生与愈伤组织形成之间平衡的观点。

流式细胞术揭示了丛生芽与黄色愈伤组织之间基本的细胞学区别。作为异源四倍体（2n = 4x = 36），4C DNA含量代表藜麦正常体细胞状态。丛生芽表现出稳定的4C谱，而黄色愈伤组织呈现复杂的倍性模式，包含多倍体（8C、16C）和可能非整倍体核的多个峰。这一细胞学证据表明稳定倍性与再生能力密切相关，尽管因果关系尚待确定。

转录组分析揭示了两种激素方案下的不同分子程序。丛生芽中防御相关基因和转录因子的上调可能反映了细胞保护机制的激活，与流式细胞术观察到的稳定倍性一致。再生幼苗从丛生芽的转变特征是从形态发生向功能成熟的转变，光合机构的激活表明再生幼苗从异养向自养的关键发育转变。

"淀粉和蔗糖代谢"（ko00500）被鉴定为再生过程中最显著重编程的通路之一。分解代谢酶的上调表明碳水化合物储备的活跃动员以驱动生物合成。DEG筛选鉴定出两个DOF基因和一个WRKY基因作为候选基因，因DOF和WRKY转录因子已知可调控碳氮平衡和糖信号，这些候选基因可能介导激素信号与下游代谢之间的串扰。

靶向代谢组学揭示了再生幼苗与对照幼苗相比的显著差异，包括主要可溶性糖的显著降低和D-甘露糖的升高，表明再生植物可能主动动员和利用碳水化合物储备以驱动生物合成过程。重要发现是必需氨基酸和关键代谢节点（谷氨酸、天冬氨酸）的升高，以及脯氨酸等应激相关氨基酸的降低。脯氨酸的降低可能表明与愈伤组织培养相关的生理应激减少，而大多数蛋白氨基酸的升高可能表明活跃的氮同化和蛋白质合成能力。从营养角度看，必需氨基酸的积累尤为重要，表明该再生体系可能产生营养潜力增强的植株。

研究结论为：该研究提供了四个主要发现：（i）建立了基于N6的高效藜麦芽再生体系，诱导率达93.5%；（ii）倍性稳定性与再生能力密切相关；（iii）再生组织中淀粉和蔗糖分解代谢早期激活；（iv）再生植株中必需氨基酸积累。这些结果共同表明基因组稳定性与成功再生之间存在密切关联，将激素信号与细胞周期调控、应激防御和代谢重塑联系起来。

研究局限性包括：机制模型基于两种激素方案的比较而非靶向单激素实验推断，直接验证因果关系仍需进行；实验仅在单一基因型（LC01）中进行，再生效率和分子响应可能具有基因型依赖性，其普遍适用性需在更多基因型中验证；流式细胞术虽揭示了核DNA含量分布的改变，但无法直接鉴定特定染色体异常，未来需通过染色体计数或FISH等互补细胞遗传学方法确认可能的非整倍体。此外，在藜麦中建立稳定的转化和CRISPR/Cas9工具对未来的基因功能研究尤为重要。