超小金纳米团簇Au25(p-MBA)18抑制结肠癌细胞生长：尺寸依赖的核穿透与细胞毒效应

《Aggregate》：Ultrasmall Gold Nanoclusters Inhibit Colon Cancer Cell Growth

　　

超小金纳米团簇（AuNCs）因其尺寸精确可控及良好的生物通透性，在生物医学应用中受到广泛关注。本研究选取了超小AuNCs Au₂₅(p-MBA)₁₈以及直径分别为5和12 nm的较大金纳米颗粒（AuNPs），所有材料均经同一配体功能化，以研究尺寸依赖的细胞毒性。研究在包括HCT116、SW480和SW620在内的多种结直肠癌（CRC）细胞系中评估了其生物学效应。结果表明，Au₂₅(p-MBA)₁₈对多种CRC细胞系表现出显著细胞毒性，而较大AuNPs则未表现出可比拟的细胞毒效应。为探究该尺寸依赖行为的起源，研究人员采用扫描透射电子显微镜（STEM）检测了这些纳米材料在HCT116细胞中的摄取及亚细胞定位。STEM分析显示，在HCT116细胞内化后，较大AuNPs进一步穿透细胞核的能力有限，而Au₂₅(p-MBA)₁₈则能够进入核区域。这些发现证明了超小AuNCs的高生物活性，凸显了其与较大AuNPs相比在生物医学及抗癌应用中的独特潜力。研究结果进一步揭示了不同尺寸金纳米材料所表现出的差异核穿透能力，为其与CRC细胞的尺寸依赖相互作用提供了机制性见解。最后，本工作证明了STEM作为一种强大的高分辨率技术，在复杂生物环境中可视化及表征超小AuNCs方面的价值。

近年来，组成精确的金纳米团簇（AuNCs，由几个至几十个金原子构成的超小纳米材料）因其原子级精确组成、明确结构及独特的尺寸依赖性质，在生物医学领域受到广泛关注。与传统等离体金纳米颗粒（AuNPs，尺寸通常大于2 nm的贵金属纳米材料）不同，AuNCs表现出离散的电子结构、类分子特性及更强的量子限域效应，在光学、催化及生物学行为上展现出独特优势。尽管AuNCs已在宫颈癌HeLa细胞、肝癌HepG2细胞及肺癌A549细胞等模型中用于成像、增敏辐射及生物安全性研究，但针对结直肠癌（CRC，一种具有高度遗传异质性和分子异质性的恶性肿瘤）的报道仍相对有限，且多数研究依赖单一细胞系。CRC细胞系在遗传和分子特征上的差异可能显著影响纳米材料摄取效率及敏感性响应。更关键的是，AuNCs与AuNPs的尺寸和表面化学往往协同变化，导致区分颗粒尺寸的固有生物效应极为困难。因此，在表面化学恒定的前提下建立尺寸-亚细胞定位-生物活性关系，成为理解纳米-生物相互作用及指导金纳米材料理性设计的核心问题。

为系统回答上述问题，研究人员选取了超小AuNCs Au₂₅(p-MBA)₁₈与两种较大AuNPs（直径分别为5 nm和12 nm），所有材料表面均修饰同一种配体p-MBA，从而最大程度消除表面化学差异，凸显尺寸的独立效应。研究在HCT116、SW480及SW620三种不同遗传背景的CRC细胞系中评估细胞毒性，并借助扫描透射电子显微镜（STEM，一种利用会聚电子与物质相互作用成像的高分辨技术）直接可视化纳米材料在细胞内的亚细胞分布。该研究发表在《Aggregate》上，为揭示金纳米材料尺寸效应的物理机制提供了关键实验证据，并对纳米药物设计具有重要指导意义。

研究人员采用CO介导还原法合成Au₂₅(p-MBA)₁₈，通过硼氢化钠还原及配体交换法分别制备5 nm和12 nm p-MBA功能化AuNPs。利用紫外-可见吸收光谱（UV–vis，用于分析材料光学吸收特性）、核磁共振波谱（NMR，用于表征分子结构纯度）、透射电子显微镜（TEM，用于形貌和尺寸分析）、扫描透射电子显微镜-能谱（STEM-EDS，用于元素分布分析）对材料光学性质、纯度、形貌、尺寸及元素分布进行系统表征，并采用电感耦合等离子体质谱（ICP，用于元素定量分析）测定金浓度。细胞毒性通过克隆形成实验和Cell Counting Kit-8（CCK-8，一种基于四唑盐还原反应的细胞活力检测法）在HCT116、SW480和SW620三种CRC细胞系中评估；亚细胞定位研究中，细胞样品经戊二醛固定、梯度脱水、树脂渗透包埋及超薄切片（约70 nm）后，直接采用TEM和STEM观察，全程无需荧光标记或银增强。

1. 纳米材料合成与表征
UV–vis光谱显示Au₂₅(p-MBA)₁₈呈现特征吸收峰，较大AuNPs表现出典型的局域表面等离子体共振（LSPR，由自由电子集体振荡引起的光学吸收）带；NMR证实AuNCs纯度良好；TEM显示所有材料分散均匀、形貌均一，较大AuNPs平均粒径为5 ± 1 nm和12 ± 1 nm。STEM-EDS元素分布图像显示Au与S信号空间共定位且均匀分布，Au₂₅(p-MBA)₁₈实测Au:S原子比为1.33，与理论值25:18（即1.39）相符，验证了原子级精确纳米团簇的成功合成及p-MBA配体的有效功能化。

2. AuNCs对HCT116细胞的显著细胞毒性
克隆形成实验表明，Au₂₅(p-MBA)₁₈处理组形成的克隆数显著少于对照组，而5和12 nm AuNPs组与对照组无显著差异。CCK-8实验进一步证实，AuNCs以浓度依赖方式降低HCT116细胞活力，在75和150 μM金原子浓度下细胞存活率降至约50%，300 μM时进一步降至约30%；相同浓度下两种较大AuNPs均未引起细胞活力显著变化，表明超小AuNCs具有强细胞毒性而较大AuNPs毒性极小。

3. 尺寸依赖性细胞毒性在多种CRC细胞系中的普适性
在SW480和SW620细胞中，Au₂₅(p-MBA)₁₈同样显著降低细胞活力，最低浓度下存活率约40%–50%，最高浓度时降至约30%，呈明显浓度依赖关系；5 nm AuNPs在此条件下未显示显著细胞毒效应。该结果证实Au₂₅(p-MBA)₁₈的尺寸依赖毒性在不同遗传背景的CRC细胞系中一致存在，提示其对CRC细胞具有广泛活性。

4. 5 nm AuNPs的亚细胞定位局限于细胞质溶酶体
TEM观察显示，HCT116细胞质内可见大量电子致密5 nm AuNPs，主要分布于细胞质中，虽可紧邻核膜出现，但均未进入核内，且常包裹于膜结合囊泡内，表现为典型溶酶体定位。这表明5 nm AuNPs虽能被HCT116细胞高效内化，但被有效限制在细胞质溶酶体中，核膜阻止了其核内渗入。

5. STEM揭示AuNCs可穿透进入细胞核
鉴于常规TEM难以分辨超小AuNCs，研究人员采用STEM对同一细胞进行成像。STEM凭借高角度环形暗场（HAADF，一种对原子序数敏感的高分辨成像模式）的高Z对比度和增强的空间分辨率，更清晰呈现质膜、核膜及核质边界，显著降低支持碳膜的背景干扰。多视野、逐级放大的高分辨STEM成像显示，Au₂₅(p-MBA)₁₈不仅存在于细胞质，还稳定地离散分布于细胞核内，在含或不含可见核仁的区域均可观察到，且无大聚集现象。相比之下，5 nm AuNPs即使紧邻核膜也无法进入核内。这直接证明超小AuNCs能够跨越核屏障并在核内累积，而较大AuNPs不具备此能力。

讨论部分指出，尽管Au₂₅(p-MBA)₁₈与较大AuNPs具有相同的表面配体，两者细胞毒性的显著差异表明颗粒尺寸可深刻影响生物活性。该尺寸依赖毒性在SW480及其转移株SW620中均存在，说明超小AuNCs的生物学效应不仅限于单一CRC模型，而可能跨越不同CRC亚型。亚细胞定位差异为尺寸依赖生物活性提供了机制解释：当表面化学恒定时，尺寸成为细胞内定位的关键决定因素。Au₂₅(p-MBA)₁₈因尺寸缩减至原子精确尺度而获得核可及性，而5 nm AuNPs则因被溶酶体捕获而缺乏核可及性，这可能是其细胞毒性极低的主要原因。研究认为，较大AuNPs有限的核可及性源于其被溶酶体囚禁后的定位限制，而超小AuNCs进入核内可能是其高生物活性基础。该工作建立了尺寸-亚细胞定位-生物活性的直接关系，凸显了原子精确Au₂₅(p-MBA)₁₈作为研究纳米-生物相互作用模型体系的价值，并强调STEM无需荧光标记即可在复杂生物环境中高对比度、高分辨率可视化超小AuNCs的独特优势。

研究结论：本工作系统研究了p-MBA功能化金纳米材料在CRC细胞中的尺寸依赖细胞毒性，比较了Au₂₅(p-MBA)₁₈与5及12 nm AuNPs。结果表明颗粒尺寸对金纳米材料生物活性具有决定性作用：超小Au₂₅(p-MBA)₁₈表现出显著细胞毒性，而较大AuNPs细胞毒效应极小。Au₂₅(p-MBA)₁₈在HCT116、SW480及SW620等多种CRC细胞模型中表现出一致的细胞毒性，提示该尺寸依赖效应在CRC亚型中具有普适性。细胞活力分析与胞内成像表明，较大AuNPs主要局限于溶酶体区室且核可及性有限，而超小AuNCs可同时分布于细胞质和细胞核。这些发现确立了纳米颗粒尺寸、细胞内定位与细胞毒性之间的直接关联，证明超小AuNCs独特兼具高效核穿透能力和多CRC细胞系显著细胞毒性。该研究同时强调了STEM成像在无需额外荧光标记的情况下，为复杂生物环境中的超小AuNCs提供比常规TEM更高对比度和空间分辨率可视化的优势，为理解纳米-生物相互作用及推动超小AuNCs在癌症相关生物医学中的应用提供了重要实验依据。