《Cancer Science》：ADAM19 Promotes EMT-Related Changes and Serves as a Prognostic Marker in Circulating Tumor Cells of Renal Cell Carcinoma
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检测循环肿瘤细胞（CTCs），尤其是表征其上皮-间质转化（EMT）表型，可能提高恶性肿瘤预后评估的准确性。鉴定用于CTCs分类的新型生物标志物可能改善对肿瘤进展的刻画，并为肾细胞癌（RCC）提供潜在的治疗思路。在此，研究人员发现，含解整合素和金属蛋白酶结构域的
检测循环肿瘤细胞（CTCs），尤其是表征其上皮-间质转化（EMT）表型，可能提高恶性肿瘤预后评估的准确性。鉴定用于CTCs分类的新型生物标志物可能改善对肿瘤进展的刻画，并为肾细胞癌（RCC）提供潜在的治疗思路。在此，研究人员发现，含解整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白19（ADAM19）与CTCs的EMT表型相关。体外功能实验、Western blotting和RNA测序表明，ADAM19促进RCC恶性进展和EMT相关变化，并与NOTCH和NF-κB信号通路相关。研究人员的发现进一步提示ADAM19与这些信号通路之间可能存在双向关联。与亲本肿瘤细胞相比，从异种移植小鼠模型中分离的CTCs表现出增强的增殖、迁移和侵袭能力，并伴有ADAM19表达升高。临床CTCs分析进一步揭示，ADAM19-Low-CTCs与RCC患者的不良临床结局相关。值得注意的是，更高的时间更新ADAM19-Low-CTC计数被确定为无进展生存期（PFS）的独立危险因素（HR = 1.243，95% CI：1.006–1.536）。
肾细胞癌（RCC）起源于肾小管上皮，约占所有原发性肾肿瘤的90%，全球新诊断癌症中约占2.2%。由于RCC常无症状或表现非特异，患者多在出现腹痛、血尿或腹部肿块等晚期表现时才被诊断，许多病例是在常规体检中偶然发现。目前治疗指南一般推荐手术切除为RCC的一线治疗，但约30%的术后患者发生肿瘤复发和转移，因此早期发现复发或转移对干预肿瘤进展、改善预后意义重大。循环肿瘤细胞（CTCs）是一种有前景的无创预后生物标志物：治疗前后较高的CTC计数与鼻咽癌更差预后相关，较高的间质型CTC计数与更差的总生存显著相关；CTCs检测对制定治疗计划亦有重要意义，如HER2阳性CTCs的转移性乳腺癌患者更易从抗HER2治疗中获益，CTC计数或表型的动态变化可作为疗效指标。作为潜在的转移种子，CTCs为肿瘤进展提供了重要信息，既往研究表明CTCs与促进肿瘤细胞迁移和侵袭的上皮-间质转化（EMT）密切相关。经典EMT标志物如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist虽被广泛使用，但在不同肿瘤类型间存在显著异质性，可能无法捕捉CTCs中EMT可塑性的全貌。因此，鉴定新的EMT相关标志物对于提高基于CTC的预后敏感性、揭示可靶向的转移驱动因素至关重要。基于此，研究人员旨在鉴定CTCs中新的EMT相关标志物并探究其临床意义，通过生物信息学分析将含解整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白19（ADAM19）确定为候选EMT相关基因；ADAM19属于ADAM家族，既往报道其参与上皮-肌成纤维细胞转分化，并与ADAM17、ADAM15类似具有切割功能，在肿瘤进展中发挥重要作用。研究人员进一步评估了ADAM19的表达模式、在RCC进展中的功能作用，以及其作为RCC中CTCs潜在预后标志物的临床相关性。
研究人员开展的主要关键技术方法包括：基于基因表达综合数据库（GEO）中四种恶性肿瘤原发肿瘤与CTCs的mRNA谱进行差异表达基因（DEGs）分析（阈值|log2FC| ≥ 1.5且校正p < 0.05），结合基因表达谱交互分析（GEPIA3）、分子特征数据库（MSigDB）EMT基因集、ctcRbase泛癌CTC表达数据及ChIP-Atlas的ChIP-seq数据进行生物信息学分析；通过尾静脉注射786-O细胞构建BALB/c-nude小鼠模型，30天后取血并以Ficoll密度梯度离心分离培养786-O-CTCs；采用Western blotting、CCK-8、Transwell、划痕愈合实验及RNA测序（DESeq2差异分析、GO富集与基因集富集分析（GSEA））进行体外功能与机制研究；采用外源性免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白物理关联；临床方面回顾性收集西安交通大学第二附属医院泌尿外科2024年12月至2025年9月术后行CTC检测的RCC患者资料（排除初诊即转移或既往接受新辅助/辅助治疗者），采用CanPatrol CTCs富集技术经RNA荧光原位杂交检测，按上皮标志物（EpCAM、CK8/18/19）和间质标志物（vimentin、twist）将CTCs分为上皮型（E-CTCs）、间质型（M-CTCs）和混合型（H-CTCs），并以荧光斑点计数对ADAM19表达分级（无0、低1–2、中3–9、高≥10）；统计分析使用GraphPad Prism 9和R 4.2.2，包括ROC曲线、Kaplan–Meier生存分析及时间依赖Cox回归等。研究获西安交通大学第二附属医院伦理委员会批准（ID: 2021033），并在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR2000035394）。
研究结果如下。3.1 ADAM19与EMT相关且在CTCs与原发肿瘤细胞中差异表达：对乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌和结肠癌原发肿瘤与CTCs的mRNA谱进行差异表达分析，4组DEGs交集包含78个DEGs；对这78个DEGs在RCC中进行单因素Cox回归分析，发现其中28个与RCC预后显著相关；随后分析这28个DEGs与EMT相关基因表达的相关性，发现ADAM19与EMT特征高度相关，最大相关系数为0.86（p < 0.05）；生存分析表明RCC患者中ADAM19高表达与更短的总生存和无病生存显著相关；在ctcRbase中检索发现，依据现有数据，ADAM19在乳腺癌、肝细胞癌和黑色素瘤的CTCs中水平高于原发肿瘤。上述结果提示ADAM19可能在CTCs中较原发肿瘤表达更高，并可能与CTCs的恶性表型相关。3.2 ADAM19促进RCC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT：比较RCC细胞系（786-O、ACHN、OS-RC2）与永生化近端小管上皮细胞（HK-2）中ADAM19蛋白表达，发现ADAM19在RCC细胞中高表达，尤其在786-O细胞中；随后在ACHN和OS-RC2中过表达ADAM19、在786-O中敲低ADAM19，786-O细胞中ADAM19敲低下调间质标志物N-cadherin、Vimentin和Slug的蛋白表达水平，同时上调上皮标志物E-cadherin，而ACHN和OS-RC2中过表达ADAM19产生相反效应；CCK-8实验显示ADAM19过表达显著促进RCC细胞增殖；划痕愈合和Transwell迁移/侵袭实验表明ADAM19表达与RCC细胞迁移和侵袭能力正相关。3.3 ADAM19与NOTCH/NF-κB信号通路的关联：为探究ADAM19如何参与EMT，研究人员进行RNA测序和生物信息学分析，GSEA进一步支持ADAM19与EMT相关基因特征相关；KEGG富集与GSEA联合分析显示ADAM19与NOTCH和NF-κB信号通路显著相关；在786-O和OS-RC2细胞系中进一步验证，786-O细胞中敲低ADAM19显著降低通路激活相关蛋白水平，包括NICD、Hes1、p-P65/P65和p-IκBα/IκBα比值，而OS-RC2细胞中过表达ADAM19显示相反结果；功能实验显示激活NOTCH或NF-κB通路显著促进RCC细胞迁移和侵袭；外源性Co-IP实验提示在过表达条件下ADAM19与NOTCH1或膜结合型TNF-α之间可能存在物理关联。随后的挽救实验表明，ADAM19过表达促进RCC细胞EMT、迁移和侵袭，而敲低NOTCH1或P65以抑制NOTCH或NF-κB信号通路可部分逆转ADAM19过表达诱导的效应；此外，激活NOTCH和NF-κB信号通路也上调RCC细胞中ADAM19表达，而敲低ADAM19可部分减少这些通路激活诱导的EMT相关变化、迁移和侵袭；相关性分析表明ADAM19 mRNA表达与这些通路相关转录因子RELA、RBPJ正相关，ADAM19表达在这些转录因子低表达组中亦趋于更低；公共ChIP-seq数据集显示RELA和RBPJ在ADAM19转录起始位点（TSS）附近存在占据信号，基序分析进一步在这些区域鉴定出潜在结合基序；NF-κB通路中其他转录因子（NFKB1、NFKB2、RELB）也与ADAM19表达正相关，在ADAM19 TSS附近±5 kb区域发现NFKB1和NFKB2峰。综上，这些发现提示ADAM19表达与NOTCH/NF-κB信号活性之间可能存在双向关联，并可能促成RCC细胞的EMT、迁移和侵袭。3.4 786-O-CTCs表现出增强的恶性表型：从动物模型分离的786-O-CTCs经培养后与786-O细胞比较增殖、迁移和侵袭能力，CCK-8实验显示786-O-CTCs增殖能力增强，Transwell迁移和侵袭实验显示其迁移和侵袭能力增强；同时检测蛋白表达水平发现ADAM19在786-O-CTCs中表达高于786-O细胞；敲低ADAM19显著抑制786-O-CTCs的增殖、迁移和侵袭。3.5 RCC患者CTCs中ADAM19表达与EMT表型的相关性：研究人员收集西安交通大学第二附属医院泌尿外科181份CTC样本，其中86例接受手术治疗的RCC患者具有完整临床资料被纳入；CTCs中ADAM19 mRNA表达水平分为无、低、中、高；181份样本中几乎均检测到E-CTCs和H-CTCs，而M-CTCs罕见；ADAM19表达在E-CTCs中主要为无/低，在H-CTCs中主要为中/低；由于无样本以ADAM19高表达为主，患者被分为无、低、中三组；与ADAM19-无或ADAM19-中组相比，ADAM19-无组中E-CTCs比例显著升高，而ADAM19-低或ADAM19-中组中H-CTCs比例显著更高；相关性分析显示E-CTC比例与无/低ADAM19正相关、与中/高ADAM19负相关，而H-CTC比例与低/中/高ADAM19呈正相关。3.6 CTC-ADAM19在术后RCC患者中的预后价值：为避免初始术后CTC检测时间不一带来的时间偏倚，分析限定于术后6个月内进行基线CTC检测的患者；卡方检验或Fisher精确检验表明各组间无临床参数存在显著差异，但ADAM19-无和ADAM19-低组肿瘤尺寸趋于小于ADAM19-中组，且中水平ADAM19表达比例在II–III期高于I期；基线单因素Cox回归确定ADAM19-Low-CTC、ADAM19-High-CTC和M-CTC计数为预后危险因素，但在基线多因素Cox回归中均未保持独立预测性；随后ROC曲线显示ADAM19-Low-CTC计数可区分随访期间有无进展的患者，AUC值为0.833；基于最大约登指数选择截断值12，Log-rank分析证实基线ADAM19-Low-CTC计数≥12与更差PFS相关；鉴于疾病进展的动态性，对86例患者中52例接受重复检测者的CTC计数变化进行分析，随访期间ADAM19-Low-CTC计数显著下降，而ADAM19-Medium-CTC计数升高；在16例接受术后Vorasidenib靶向治疗的患者中，ADAM19-Low/Medium-CTC计数的变化与总队列一致，而E-CTC和ADAM19-None-CTC与未接受靶向治疗患者相比呈现相反动态变化；时间依赖Cox回归显示，单因素分析中时间更新ADAM19-Low-CTC计数、疾病分期和靶向治疗为预后因素，仅更高的时间更新ADAM19-Low-CTC计数作为独立不良预后因素（HR = 1.243，95% CI：1.006–1.536）。
讨论部分总结：CTC检测为监测肿瘤进展和指导临床决策提供有价值的信息，但其临床应用受CTCs稀少和异质性限制；EMT在肿瘤进展中发挥重要作用，并促成CTC生成、存活和转移定植，既往研究表明EMT使CTCs能够抵抗失巢凋亡、剪切应力和免疫细胞介导的杀伤，从而较原发肿瘤细胞表现出更多间质特征；然而EMT是动态可逆过程，CTCs可存在上皮、间质和混合表型，这些亚群可在同一患者中共存并在肿瘤进展或治疗干预中变化；在许多癌症中较高CTC计数与不良预后相关，同时M-CTCs和H-CTCs与不良预后相关，而E-CTCs通常与更有利预后相关；传统CTC分离方法依赖EpCAM和细胞角蛋白等上皮标志物，会低估间质CTC群体，因此鉴定新的EMT相关标志物可能改善CTC分类并促进临床应用。本研究中研究人员发现ADAM19在CTCs与原发肿瘤细胞间差异表达，CTCs中表达更高，ADAM19表达与RCC中CTCs的EMT表型相关；功能实验进一步提示ADAM19可能促成EMT相关变化以及RCC细胞的增殖、迁移和侵袭；研究人员还鉴定出ADAM19与NOTCH和NF-κB信号通路的关联，结果提示ADAM19可能在这些通路参与下促成RCC细胞的EMT相关变化、迁移和侵袭，并提示ADAM19与NOTCH/NF-κB通路活性之间可能存在相互关联；鉴于ADAM家族成员的蛋白水解功能，研究人员推测ADAM19可能通过对通路相关分子的蛋白水解加工影响下游信号，初步研究显示过表达条件下ADAM19与NOTCH1或膜结合型TNF-α可能存在相互作用，但这些数据不能确定相互作用是直接的还是促成通路激活，需进一步开展内源性Co-IP和邻近连接实验等；公共数据也提示NOTCH/NF-κB通路转录因子与ADAM19之间可能存在调控关联，尤其是RELA和RBPJ，但仍需双荧光素酶报告基因实验和ChIP-qPCR等进一步实验确定这些转录因子是否直接调控ADAM19转录。此外，动物来源的786-O-CTCs较亲本细胞表现出显著增强的增殖、迁移和侵袭能力，与其他肿瘤类型报道一致；786-O-CTCs中ADAM19上调，敲低ADAM19显著抑制其增殖、迁移和侵袭；临床上患者CTC数据显示ADAM19表达与CTCs的EMT表型相关，相关性分析显示ADAM19-None-CTC计数与E-CTC计数显著相关，ADAM19-Low-CTC计数与H-CTC和E-CTC计数均显著相关，ADAM19-Medium/High-CTC计数与H-CTC计数显著相关；尽管本队列中M-CTC计数不足以进行可靠统计分析，观察到的分布模式提示不同水平ADAM19表达可能与CTCs不同EMT状态相关，这些观察需在更大队列中验证；总体而言，细胞功能实验提示ADAM19可能促成EMT相关变化，且ADAM19表达与CTCs的EMT表型存在显著相关性，但现有RCC细胞体外结果和单中心CTC数据不足以确立ADAM19为反映EMT状态的可靠指标，需进一步大规模多中心临床验证和深入机制研究以确定其生物标志物潜力和理解潜在调控机制。在生存分析中，基线术后ADAM19-Low-CTC计数与PFS相关，截断值12源自本队列；基线Cox回归显示首次术后CTC检测时M-CTC、ADAM19-Low-CTC和ADAM19-High-CTC计数与PFS相关，但均未保持独立预后因素；纵向随访中，重复CTC评估患者中ADAM19-Low-CTC计数下降而ADAM19-Medium-CTC计数升高，此外E-CTC和ADAM19-None-CTC在接受与未接受靶向治疗患者间呈现不同动态趋势；为评估纵向CTC变化的预后影响，研究人员进一步进行时间依赖Cox回归分析，显示更高的时间更新术后ADAM19-Low-CTC计数是PFS的独立危险因素，而时间更新ADAM19-Medium-CTC、ADAM19-None-CTC和E-CTC计数与PFS无显著关联；ADAM19-Low-CTC的预后模式似乎与显示高ADAM19表达促进培养的786-O和786-O-CTC细胞恶性表型的功能实验不一致，这一差异可能由样本量有限、随访时间短和ADAM19-Medium/High-CTCs检测频率低解释，后者可能降低识别其预后效应的统计效能；或者ADAM19-Low-CTCs可能代表同时具有上皮和间质特征的中间EMT状态，可能促进循环中的存活和转移进展，但该假设需通过对分离CTC亚群的功能表征进一步验证；尽管研究结果提示CTCs中ADAM19表达可能具有预后潜力，但临床应用前仍需进一步验证，ADAM19-Low-CTC截断值源自单中心队列，需在随访方案标准化的独立队列中确认，还需更长期随访的更大规模研究以阐明包括ADAM19-High-CTCs和CTC簇在内的罕见CTC亚群的预后意义，未来研究应进一步评估不同CTC亚群（包括CTC簇）中的ADAM19表达，可能提供额外的预后信息。总之，研究人员的发现提示ADAM19促成RCC迁移、侵袭和EMT相关变化，并与NOTCH/NF-κB通路活性相关；CTCs中ADAM19表达与EMT表型及不良预后相关，提示其作为EMT相关CTC参数的潜在价值；仍需多中心验证和机制研究以确定其临床效用和生物学功能。研究结论译文：研究人员的发现提示ADAM19促成RCC迁移、侵袭和EMT相关变化，并与NOTCH/NF-κB通路活性相关；CTCs中ADAM19表达与EMT表型及不良预后相关，提示其作为EMT相关CTC参数的潜在价值；仍需多中心验证和机制研究以确定其临床效用和生物学功能。
