《Cell Proliferation》：Purpurin Alleviates Meniscal Senescence and Osteoarthritis by Blocking the Non-Metabolic Function of Hexokinase 2
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半月板退变以细胞外基质（ECM）丢失和细胞衰老为特征，在骨关节炎（OA）进展中起关键作用，但其潜在机制尚不清楚。尽管己糖激酶2（HK2）被认为是关键的糖酵解酶，但其在半月板中的潜在非代谢功能尚未被探索。本研究评估了人OA与正常半月板组织中HK2的表达，并利用
半月板退变以细胞外基质（ECM）丢失和细胞衰老为特征，在骨关节炎（OA）进展中起关键作用，但其潜在机制尚不清楚。尽管己糖激酶2（HK2）被认为是关键的糖酵解酶，但其在半月板中的潜在非代谢功能尚未被探索。本研究评估了人OA与正常半月板组织中HK2的表达，并利用过表达、敲低和定点突变在原代半月板细胞中研究了其非代谢效应；通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）和免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白相互作用。HK2在OA半月板组织中显著上调，过表达催化失活的HK2以MYH10依赖的方式促进半月板ECM降解和细胞衰老。机制上，HK2增强MYH10–PRKN相互作用，诱导MYH10在赖氨酸410位点的K48连接泛素化及其随后的蛋白酶体降解，从而降低COL1A1 mRNA稳定性。通过虚拟筛选鉴定的Purpurin在体外破坏HK2–MYH10相互作用，阻止MYH10降解并减轻细胞衰老。在内侧半月板失稳（DMM）小鼠模型中，关节腔内注射表达催化失活HK2的腺相关病毒加剧OA进展，而Purpurin治疗减轻半月板退变、ECM丢失和OA相关疼痛。总之，HK2通过非代谢、MYH10依赖的机制促进半月板衰老和OA进展，Purpurin是开发疾病修饰性骨关节炎药物（DMOAD）的有前景的先导化合物。
## 论文解读
**研究背景** 骨关节炎（OA）累及全球近6亿人，是重大公共卫生负担。半月板损伤与OA风险升高密切相关。半月板是位于股骨与胫骨之间富含细胞外基质（ECM）的高度有序组织，I型胶原占其ECM干重90%以上，对分散应力、维持膝关节功能至关重要。半月板退变主要发生于无血管白区，以I型胶原丢失为突出表现，损害损伤后再生能力。细胞衰老是OA另一关键病理过程，以不可逆细胞周期阻滞、功能衰退及衰老相关分泌表型（SASP）因子分泌增加为特征；衰老细胞线粒体功能障碍导致活性氧（ROS）过度产生，引发氧化应激与DNA损伤。清除衰老细胞可建立促再生微环境。滑膜和软骨细胞衰老已被证实参与OA进展，但半月板衰老在OA中的作用尚不清楚。HK2是糖酵解途径首个限速酶，半月板为相对缺氧组织，细胞主要依赖糖酵解供能，使HK2对维持半月板稳态十分重要。除代谢功能外，越来越多证据提示HK2具有非糖酵解调控作用，如急性髓系白血病中核内HK2调控干/祖细胞功能、前列腺癌中HK2 SUMO化丢失促进线粒体结合、HK2作为蛋白激酶磷酸化鞘磷脂酶1加重脑损伤。但HK2调控半月板功能的非代谢作用仍不清楚。Purpurin是源自茜草（Rubia cordifolia）的天然蒽醌，具有抗氧化、抗炎活性，包括清除自由基、降低细胞内ROS、抑制NLRP3炎症小体组装及下调IL-1β，但其对半月板衰老或OA进展的保护作用未知。因此，研究人员开展本研究以阐明HK2在半月板中的非代谢功能及Purpurin的治疗潜力。
**关键技术方法** 研究采用人OA半月板（全膝关节置换术获取）与正常半月板（无关节炎病史的严重创伤截肢患者）原代细胞；构建HK2过表达、敲低及定点突变体（D209A/D657A催化失活、Y865A/K866A/Q892A结合缺陷）；采用IP-MS鉴定HK2互作蛋白、Co-IP验证相互作用、RNA免疫沉淀（RIP）-RT-qPCR检测MYH10与COL1A1 mRNA关联；通过放线菌素D追踪实验检测mRNA半衰期；采用分子对接、虚拟筛选（3219种天然产物）及100 ns分子动力学模拟；建立内侧半月板失稳（DMM）小鼠模型并关节腔注射AAV9-HK2/AAV9-mut-HK2及Purpurin。
**研究结果** （1）HK2在OA半月板中显著上调：SA-β-Gal染色显示OA半月板衰老细胞比例升高，RNA-seq（GSE335572）及临床标本显示HK2 mRNA与蛋白显著上调，COL1A1降低而MMP3、P16、P21、P53升高，DMM及18月龄自然衰老鼠半月板HK2亦升高。（2）HK2过表达加剧半月板胶原丢失并诱导细胞衰老：过表达HK2降低COL1A1、升高MMP3与衰老标志物、减少线粒体膜电位、增加ROS；敲低HK2则相反；但OA半月板及TBHP处理细胞总己糖激酶活性无变化，催化失活mut-HK2仍保留促分解代谢和促衰老能力，提示效应不依赖代谢活性。（3）抑制HK2以MYH10依赖方式促进胶原表达并抑制衰老：IP-MS鉴定MYH10为HK2互作蛋白（54条独特肽段，覆盖46%），RIP证实MYH10与COL1A1 mRNA关联；HK2敲低的保护效应被MYH10敲低逆转；Transwell共培养显示旁分泌效应；ROS清除剂NAC部分减轻衰老但仅部分恢复COL1A1，提示ECM失调与衰老为相互关联但部分可分的下游后果。（4）HK2促进MYH10–PRKN复合物形成及MYH10泛素化降解：HK2过表达增加MYH10多泛素化，MG132处理致MYH10时间依赖性累积；数据库预测PRKN为MYH10的E3连接酶，PRKN敲低延缓MYH10降解，过表达则增强其泛素化；HK2过表达增强MYH10–PRKN互作；结合缺陷突变体Flag-Mut2-HK2保留酶活性但丧失促MYH10–PRKN复合物形成能力，证明HK2通过非催化支架机制发挥作用；PRKN敲低可阻断HK2下游效应。（5）PRKN诱导MYH10 K48连接泛素化，K410为关键位点：PRKN促进K48而非K63连接泛素化；K232R、K410R、K828R突变体中仅K410R显著减弱泛素化；K410在人类、小鼠、大鼠和牛中高度保守；MYH10K410R在HK2过表达下保持稳定并维持COL1A1蛋白水平及mRNA半衰期。（6）HK2非代谢功能加剧OA进展：DMM小鼠关节腔注射AAV-HK2或AAV-mut-HK2均加重关节疼痛、步态异常、骨赘形成、半月板退变、I型胶原减少及MMP3、P21阳性细胞增多，并加剧软骨蛋白多糖丢失，但不加重滑膜炎症。（7）Purpurin通过破坏HK2–MYH10互作抑制MYH10泛素化：虚拟筛选获得5个结合能优于?5.0 kcal/mol的先导化合物，其中arcyriaflavin A和purpurin在15 μM下无细胞毒性，purpurin显著减少OA半月板细胞衰老；purpurin浓度依赖性上调HK2过表达细胞中MYH10蛋白，减少MYH10–PRKN互作及MYH10泛素化，延长COL1A1 mRNA半衰期；分子对接显示purpurin通过与LYS-866/TYR-865形成氢键、与GLN-892疏水作用占据HK2的MYH10结合口袋，100 ns分子动力学模拟证实复合物稳定结合。（8）Purpurin减轻DMM诱导的半月板退变：purpurin缓解关节疼痛、改善步态、恢复热痛阈值、减少骨赘形成、减轻半月板退变、部分恢复COL1A1并降低MMP3和P21，同时减少软骨蛋白多糖丢失并减轻滑膜炎症。
**讨论与结论** 讨论指出，OA软骨细胞存在向糖酵解转变的代谢重编程，抑制HK2可减轻分解代谢与炎症，而本研究显示OA半月板HK2显著上调，支持HK2促进PRKN介导的MYH10降解、MYH10耗竭导致COL1A1 mRNA不稳定及线粒体功能障碍与ROS增加促衰老的模型；四条证据支持其不依赖代谢活性：OA半月板总己糖激酶活性不变、催化失活突变体保留效应、AAV-mut-HK2与AAV-HK2在体内同样加剧OA、催化完整但结合缺陷突变体丧失功能。HK2蛋白升高而酶活性不变可能与翻译后修饰、产物反馈抑制、非催化构象或亚细胞分布改变有关。与既往报道的HK2支架功能稳定互作蛋白不同，本研究揭示HK2通过E3连接酶-底物支架机制促进互作伙伴降解，拓展了对糖酵解酶非经典功能的认识。研究还指出MYH10与COL1A1 mRNA的关联可能经RNA结合蛋白LARP6介导，尚待确定。Purpurin既往被报道具有抗类风湿关节炎和抗衰老活性，本研究首次揭示其抗半月板衰老特性，且不同于直接抑制HK2酶活性可能干扰全身糖代谢，purpurin通过破坏非代谢性HK2–MYH10互作实现更精准的病理干预。研究局限性包括：缺乏覆盖不同OA分期的半月板标本库；对照与OA供者年龄不匹配且TBHP为氧化应激诱导的衰老样模型；未直接评估线粒体自噬标志物；未进行生物力学分析；purpurin的药代动力学、系统安全性和长期疗效未评估，其抗氧化抗炎活性可能带来脱靶贡献；体内实验仅使用12周龄雄性C57BL/6小鼠，不能直接外推至女性。研究结论译为：总之，研究结果证明HK2在OA半月板中表达上调，为HK2在OA进展中的病理作用提供了见解。HK2水平升高促进MYH10与E3泛素连接酶PRKN之间的相互作用，导致MYH10泛素化与降解。MYH10水平降低随后损害其与COL1A1 mRNA的关联，从而缩短mRNA半衰期，破坏半月板ECM稳态并促进细胞衰老。总之，HK2/MYH10/PRKN轴的失调损害半月板ECM完整性并加速半月板衰老和OA进展。
