基于聚合物-脂质杂化囊泡的人工细胞实现人CYP2D6的功能性无细胞表达

《ChemBioChem》：Expression of Human CYP2D6 in Artificial Cells Based on Polymer-Lipid Hybrid Vesicles

　　

具备表达功能性、生物医学相关酶能力的人工细胞长期以来是自下而上合成生物学领域的目标。在此，研究人员证明，可利用基于原生动物Leishmania tarentolae的无细胞蛋白表达系统，在巨大杂化囊泡基人工细胞的腔内表达人细胞色素P450 2D6（CYP2D6）。囊泡膜由1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）以及含聚（甲基丙烯酸胆固醇酯-co-甲基丙烯酸丁酯）[p(CMA-co-BuMA)]并以聚（半乳糖甲基丙烯酸酯）（pGalacMA）或聚（羧乙基丙烯酸酯）（PCEA）为亲水嵌段的两亲性嵌段共聚物组成。嵌入巨大杂化囊泡膜的嵌段共聚物的量和组成改变了人工细胞支持功能性蛋白表达的能力，这可能通过膜性质变化实现。特别是，含pGalacMA的巨大杂化囊泡支持产生具有酶活性的CYP2D6。总体而言，所报道的方法推动了能够产生功能性、生物医学相关酶的人工细胞的发展。此外，该工作凸显了聚合物性质与生物组分性能之间在聚合物-脂质杂化囊泡可实现功能复杂性中的复杂相互作用。

研究背景：细胞稳态依赖多样蛋白在适当时空受调控表达。分离蛋白合成所需细胞组分已成为解析遗传密码及体外生产蛋白和蛋白基系统的重要策略。常用无细胞蛋白合成（CFPS）平台包括大肠杆菌S30提取物和基于纯化组分的PURE系统，但其生产全长、有活性真核蛋白，尤其需复杂折叠、辅因子、膜结合或翻译后加工者，效率可能较低。这推动基于哺乳动物或昆虫细胞、小麦胚及单细胞真核生物的CFPS发展。基于Leishmania tarentolae的LTE系统在成本与真核表达背景间提供折中，已用于生产难功能表达的人细胞色素P450（CYP450s），其活性可能由LTE裂解液中残留微粒体膜片段支持，使CYP450s与同源电子交换伙伴共同嵌入。人工细胞（ACs）通过自下而上或自上而下策略模仿活细胞选定特征；自下而上策略已复制分裂、细胞骨架样结构组装和蛋白表达等功能。巨大单层囊泡（GUVs）是目前常用细胞模拟支架，已用于封装大肠杆菌和PURE CFPS，并实现可溶蛋白腔内生产、功能膜蛋白共翻译插入、磷脂合成乃至编码PURE翻译酶的自我复制基因组。聚合物囊泡也被探索为AC支架，例如小麦胚CFPS在聚合物囊泡膜中表达G蛋白偶联受体。巨大杂化囊泡（GHVs）由脂质和两亲性嵌段共聚物组装，已有CFPS共翻译插入膜蛋白的进展；但据研究人员所知，真核CFPS在杂化囊泡中的应用尚未被探索。CYP2D6是膜相关药物代谢酶，参与近20%常用处方药代谢，主要为镇痛药、抗抑郁药、抗高血压药和抗癌药；其高多态性造成药物代谢与治疗反应个体差异，具有重要生物医学意义。CYP450s因膜结合需求而难以在无细胞和细胞系统中高水平生产。LTE已成功表达有酶功能的CYP2D6及其同源电子交换伙伴，因此研究人员开展本研究，检验GHV基ACs作为LTE裂解液CFPS支架表达CYP2D6的可行性。

研究人员开展的研究与结论：研究人员将LTE裂解液及编码CYP2D6和人NADPH-细胞色素P450还原酶（hCPR）的质粒封装于由DOPC与不同量/组成嵌段共聚物（BCP1或BCP2）组装的GHVs，并与GUV比较；先以增强绿色荧光蛋白（eGFP）验证腔内蛋白合成，再以CYP2D6-eGFP监测表达，最后以未标记CYP2D6和AMMC转化为AMHC的荧光反应检测酶活性。结论是GHVs可封装LTE组分、支持腔内蛋白合成并实现功能性CYP2D6表达；含pGalacMA的GHVs支持产生有酶活性的CYP2D6，低聚合物含量杂化囊泡最适于CYP2D6表达并可检测到酶活。该工作推进了能产生功能性、生物医学相关酶的人工细胞发展，并揭示聚合物性质与生物组分性能之间的复杂相互作用。

技术方法：研究采用基于Leishmania tarentolae裂解液（LTE）的无细胞蛋白表达系统，质粒编码eGFP、CYP2D6-eGFP、未标记CYP2D6及hCPR；以双乳液转移法将LTE组分、底物和质粒封装于DOPC与BCP1/BCP2不同摩尔比组装的GHVs。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和落射荧光显微镜追踪腔内荧光及AMMC转化为AMHC的酶活；用Laurdan的广义偏振（GP）评估膜流动性，用微吸管抽吸测定拉伸模量（K_a）和弯曲刚度（K_b）；统计采用单因素方差分析及Tukey多重比较。样本来源为LTE裂解液与合成囊泡，无患者队列。

研究结果：2.1 无细胞蛋白表达组分在GHVs中的封装（Encapsulation of Cell-Free Protein Expression Components in GHVs）：研究人员将ATP、牛血清白蛋白（BSA）和DNA作为LTE裂解液相关模型分子共封装，比较GUV与不同BCP1/BCP2膜组成；通过CLSM观察荧光标记组分并统计囊泡产量和封装效率，发现多数膜组成可形成数微米至约50–60 μm巨大囊泡，BCP2因相对较低多分散性而产量较高；高BCP2含量降低ATPf封装效率并增加聚集，BSAf和DNAf呈相似趋势；最终选择GUV及若干GHV组成用于后续。结论：GHVs可封装LTE相关组分，但组成影响产量、封装和聚集。

2.2 含BCP2巨大囊泡的流动性和弹性（Fluidity and Elasticity of BCP2-Containing Giant Vesicles）：用Laurdan的GP和微吸管抽吸比较含BCP2 GHV、GUV及含分子胆固醇GUV。无胆固醇GUV的GP约为?0.15，含BCP2的若干组成GP约降至?0.35，说明p(CMA-co-BuMA)增加膜无序和水渗透；BCP2系列随组成GP约由?0.10降至?0.35，与分子胆固醇降低膜流动性的趋势相反。K_a分别约为87、56和80 mN m^?1，差异不显著，提示某组成有较低刚度趋势；与电形成法先前约160 mN m^?1不同，双乳液转移法残留油可能影响膜刚度。结论：BCP2改变膜流动性，弹性呈弱趋势。

2.3 ACs内绿色荧光蛋白的无细胞表达（Cell-Free Expression of Green Fluorescent Protein Within ACs）：将LTE与eGFP质粒封装于AC0-eGFP、AC1.25-eGFP和AC2.5-eGFP，未标记膜，用落射荧光显微镜时间追踪。AC1.25-eGFP显著增加腔荧光囊泡比例，从30 min约6%升至120 min以上15%；AC0-eGFP从约3%升至约11%，p≤0.06；AC2.5-eGFP无增加。单囊泡最大荧光强度AC1.25-eGFP超过4.8×10⁵ a.u.，AC0-eGFP约1.9×10⁵ a.u.，AC2.5-eGFP约1.7×10⁵ a.u.。结论：BCP2为1.25的组成最适合eGFP表达，膜组成影响表达效率。

2.4 ACs内CYP2D6的无细胞表达（Cell-Free Expression of CYP2D6 Within ACs）：先封装CYP2D6-eGFP与hCPR，比较AC0-CYP2D6-eGFP、AC1.25-CYP2D6-eGFP和AC2.5-CYP2D6-eGFP；30–150 min有腔荧光囊泡比例增加，AC1.25-CYP2D6-eGFP显著，AC0-CYP2D6-eGFP和AC2.5-CYP2D6-eGFP呈强统计趋势；AC1.25-CYP2D6-eGFP最高约24%，AC0约20%，AC2.5约18%；AC1.25和AC2.5最大荧光强度超过4.0×10⁵ a.u.，AC0仅约0.17×10⁵ a.u.；荧光并非主要定位于AC膜，可能进入LTE残留微粒体。再封装未标记CYP2D6、hCPR和AMMC，37 °C后30/60 min检测AMHC；某些含BCP2组成中超过10%囊泡出现腔荧光，GUV较低；AC1.25-CYP2D6在30和60 min较15 min显著增加，60 min时显著大于AC0-CYP2D6，AC2.5-CYP2D6较AC0呈p=0.06趋势；总AMHC荧光某些含BCP2组成高于相应无质粒对照和GUV，AC2.5-CYP2D6与无质粒相近。结论：含BCP2的GHVs比GUV更有效支持CYP2D6酶活，且CYP2D6与hCPR成功共表达（无hCPR时活性很低），但表达具异质性。

讨论与结论：讨论指出，含BCP2囊泡膜流动性增加可能促进CYP2D6插入；但新合成CYP2D6并非专一定位于AC膜，LTE裂解液残留微粒体可能参与其功能。较高BCP2含量可能因p(GalacMA)与CYP2D6间空间位阻而降低膜插入效率。表达囊泡比例有限，可能源于封装造成裂解液组分相对浓度在囊泡间变异，即使补充氨基酸、核苷酸和ATP等关键化合物，仍导致转录-翻译效率异质，使相当部分囊泡低于可检测蛋白表达阈值；表达亦受LTE裂解液固有efficiency限制。研究结论部分翻译如下：在此，研究人员证明LTE裂解液可支持在杂化囊泡基人工细胞内表达荧光蛋白和具有酶活性的蛋白。研究结果表明，含BCP2的巨大聚合物-脂质囊泡比纯GUV更有效地实现基于LTE裂解液的催化功能性人CYP2D6表达。然而，表达eGFP或CYP2D6-eGFP的ACy-eGFP和ACy-CYP2D6-eGFP囊泡比例仍然有限，原因可能是封装导致裂解液组分相对浓度在囊泡间变异，即使补充氨基酸、核苷酸和ATP等关键化合物，仍造成转录-翻译效率异质，并使相当一部分囊泡低于可检测蛋白表达阈值。表达还受LTE裂解液固有efficiency限制。未来工作将聚焦提高封装和表达效率，以实现更大量酶生产；进一步工作旨在将该平台扩展到其他生物医学相关CYP450s及代谢相关通路中酶的共表达，长期目标是开发用于个性化药物代谢筛选等功能性人工细胞平台。