# 融合喹喔啉与1,2,4-三唑骨架的取代基结构对细胞毒活性及腺苷A1受体相互作用的影响

《Chemistry & Biodiversity》：Quinoxaline–Triazole Hybrids: Exploring the Impact of Substituent Architecture on Cytotoxic Potency and Receptor Interaction

　　

合成了一系列喹喔啉–1,2,4-三唑衍生物（6a–6l），并经核磁共振（NMR）与质谱表征；长链烷基成员的产率高达80%，表明取代基结构是决定合成效率的关键因素。针对MCF-7、HeLa与HepG2细胞的MTT实验确定6e与6k为活性最强的化合物，在三种细胞系中的半数抑制浓度（IC₅₀）为50.83–62.69 μg/mL。针对腺苷A₁受体的对接给出6e与6k的结合能分别为?9.02 kcal/mol与?9.24 kcal/mol，由与关键结合位点残基的疏水及π–π相互作用驱动。配体–受体复合物在600 ns分子动力学模拟过程中保持稳定，伞形采样（umbrella sampling）估算的结合自由能分别为?129.46与?88.46 kJ/mol。ADMET预测表明其具备类药性及良好的胃肠道吸收。因此，6e与6k被推选为先导候选物，用于机制、药理学及体内评价。

**研究背景**　杂环化合物是现代药物化学与合成化学的重要骨架。喹喔啉（quinoxaline）由苯环与吡嗪环稠合而成，具有富电子性、严格平面性及生物电子等排适应性，其π共轭体系与强吸电子性质使其可与酶、DNA及受体等多种生物靶标相互作用，其衍生物已被广泛研究用于抗菌、抗炎、抗结核及抗癌等方向。三唑为含三个氮原子的五元杂环，属优势片段；其中1,2,4-三唑与喹喔啉联合时活性增强，可作为刚性、极性强且代谢稳定的连接单元，形成氢键与π–π相互作用。将二者整合为单一分子框架即得喹喔啉–三唑杂合体，此类稠合杂环骨架已显示出显著生物活性，包括与庆大霉素（gentamicin）相当或更优的抗菌、抗真菌活性，以及在乳腺癌、结肠癌等多种模型中的细胞毒潜力，涉及DNA嵌入、激酶抑制与受体调节等机制。已有研究表明此类杂合体可与腺苷A₁受体（一种G蛋白偶联受体，GPCR）结合，该受体参与肿瘤生长、血管生成与免疫调节。临床上，含1,2,4-三唑环的阿那曲唑（Anastrozole）用于绝经后雌激素依赖性乳腺癌，含喹喔啉环的EAPB0203用于黑色素瘤并对多种人白血病细胞系显示细胞毒活性。此类杂合体的化学意义在于通过在三唑或喹喔啉部分选择性取代来调节位阻与电子特征，从而改变溶解度、结合亲和力与氧化还原性质；三唑环因抗水解、抗氧化与抗酶切而提升骨架稳定性。当前存在的问题是：现有喹喔啉类似物多通过单一机制发挥作用，兼具DNA嵌入潜力与受体结合能力的双药效团小分子鲜有同时优化；取代基结构（链长、亲脂性、柔性、芳香平面性）如何定量影响细胞毒效力与受体结合尚缺乏系统阐释。为此，研究人员开展了本项研究，合成了新型喹喔啉–三唑杂合体系列，进行光谱表征与系统的体外、计算机模拟抗癌筛选，重点考察其与腺苷A₁受体的相互作用，并进行ADMET（吸收、分布、代谢、排泄与毒性）分析，以确定可推进的先导化合物。

**关键技术方法**　（1）合成与表征：以4-氯邻苯二胺为起始原料，经缩合、氯代、肼解制得6-氯-2-肼基喹喔啉（5），再与系列脂肪族及芳香族羧酸（7a–7l）在氯苯/三氯氧磷中回流6–8 h缩合环化，经柱层析纯化得到6a–6l；采用核磁共振（¹H、¹³C NMR，含HSQC、HMBC、gCOSY二维谱）、高分辨质谱（HRMS）及熔点测定表征，并以D₂O交换实验确认可交换质子。（2）体外活性：人乳腺癌MCF-7（RRID: CVCL_0031）、宫颈癌HeLa（RRID: CVCL_0030）、肝癌HepG2（RRID: CVCL_0027）细胞系购自印度浦那国家细胞科学中心（NCCS），以MTT法测定细胞毒并计算IC₅₀，以顺铂（Cis）与多柔比星（Dox）为对照，采用双因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验。（3）分子对接：以AutoDock 4.2.6对全部化合物针对腺苷A₁受体（PDB ID: 5N2S）进行筛选；随后以含Gi2蛋白与腺苷（ADN）的A₁受体结构（PDB ID: 7LD3）在Maestro中经Glide XP模式完成再对接验证与6e、6k的精细对接。（4）分子动力学（MD）：以CHARMM-GUI构建嵌入POPC脂双层的体系，AMBER19SB/LIPID21/GAFF2力场参数化，各体系运行600 ns全原子模拟（合计1.8 μs采样），以GROMOS算法聚类，ProLIF生成蛋白–配体相互作用指纹，并以伞形采样（US）结合加权直方图分析（WHAM）计算解离自由能。（5）ADMET预测：采用SwissADME与pkCSM评估理化性质、亲脂性、水溶性、胃肠道吸收、血脑屏障通透性、P-糖蛋白底物、细胞色素P450抑制及类药性规则。

**研究结果**

**合成观察与结构表征**　在优化条件下以66%–80%的中等到良好产率获得目标产物。短链杂合体（C2–C4，6a–6c）产率较低；链长增至C5–C7（6d–6f）产率明显提高；延长至C9–C12（6g–6i）进一步提高；引入C18长链底物（6j）效率最高，产率达80%。相反，由肉桂酸与苯乙酸等芳香体系所得产物（6k、6l）产率明显下降。含长烷基链者熔点相对较低。通过二维核磁对化合物5k的完整归属（包括δ 9.401单峰与三唑环碳及取代苯环的相关性）确证了1,2,4-三唑环连接于喹喔啉与取代苯环的结构。

**体外细胞毒活性评价**　MTT结果显示各化合物抗增殖活性存在差异，6e（庚酸衍生物）与6k（肉桂酸杂合体）在全部细胞系中抑制效果最强，与未处理对照相比差异具有统计学意义，并与顺铂、多柔比星比较。MCF-7敏感性最高，6e柔性脂肪链可能增强膜通透性，6k芳香体系则促进与DNA或受体结合位点的π–π堆积。细胞毒并不随亲脂性线性增加：共识Log P由6a的2.37升至6j的7.73，但与平均IC₅₀的相关性弱且方向相反（r = +0.60）；两端表现均差，6a（Log P最低）平均IC₅₀为82.3 μg/mL，而6i（Log P 5.75）与6j（Log P 7.73）最弱，分别为109.8与106.3 μg/mL；活性在Log P约3.5–4.5的窄窗口内最大，由6k（3.56；53.7 μg/mL）、6e（3.75；58.2 μg/mL）与6g（4.48；60.7 μg/mL）占据。高亲脂端的活性下降与溶解度而非通透性一致：脂肪族系列预测水溶性下降约六个数量级，6j被判为不溶（ESOL Log S ?8.55，1.3 × 10^?6 mg/mL），远低于其IC₅₀测定浓度（约10^?1 mg/mL）。可旋转键数同样与平均IC₅₀相关（r = +0.64），由6a的1增至6j的16。匹配芳香对的证据最为清晰：6k（苯乙烯基）与6l（苄基）仅相差连接单元为共轭烯烃或sp³亚甲基，亲脂性（Log P 3.56 vs. 3.29）与芳香重原子数几乎相同，打断共轭损失约20%活性（53.7 vs. 64.5 μg/mL），可归因于平面性丧失；6k仅有两个可旋转键、Csp³分数为0.00，为系列中最刚性、最平面的 profile。综上，效力反映的是链长、疏水性、构象柔性、芳香平面性与水溶性共同设定的最适值而非单一趋势。HeLa与HepG2对6e、6k响应良好但抑制程度低于MCF-7，可能与受体表达谱差异及内在耐药机制有关；HepG2对所有化合物IC₅₀偏高，推测与其代谢能力强、解毒酶表达高有关。6g、6i、6f活性次之，提示长疏水链与富电子取代基增强细胞毒。6a、6b、6d等短链或疏水性较弱者活性轻微至较差。统计分析表明6e与6k的细胞毒作用未超过顺铂或多柔比星，但处于可比范围，尤以MCF-7为著。

**计算机模拟分析——分子对接**　采用AutoDock考察全部化合物与腺苷A₁受体的相互作用。6k结合亲和力最高（ΔG = ?9.24 kcal/mol，K_i = 168.03 nM），其次为6e（?9.02 kcal/mol，K_i = 246.16 nM）与6l（?8.87 kcal/mol，K_i = 520.28 nM），与ASN1359、LEU1355、PHE1276、VAL1192、ALA1171等关键疏水及芳香残基形成强接触；6k的芳香部分可能增强与PHE1276、VAL1192的π–π堆积，6e的柔性脂肪链则利于深入受体疏水核心、促进范德华（vdW）相互作用。6g与6h结合稳健（ΔG分别为?8.62与?8.61 kcal/mol，亚微摩尔K_i），与TYR1305、ALA1342、PHE1346作用，提示疏水锚定。6a与6j结合亲和力较低（?6.55与?6.76 kcal/mol，K_i为微摩尔级），可归因于不利取向或位阻。对照药物多柔比星与顺铂结合能显著更低（?5.77与?4.02 kcal/mol），后者结合可忽略（K_i = 1.12 mM）。对接数据支持腺苷受体拮抗机制，即6k与6e可能通过占据A₁受体活性位点残基而干扰下游嘌呤能信号级联（如PI3K/AKT、MAPK），与体外抗增殖效应相吻合。

**分子动力学——A₁R结合口袋内配体结合构象**　以Glide对接预测优选结合取向，并以冷冻电镜（cryo-EM）结构中ADN的构象作为参照进行再对接验证，显示高度结构一致性（对接分数ADN = ?8.12、6e = ?6.37、6k = ?6.30 kcal/mol），关键极性接触得以保留，仅核糖部分个别原子出现可忽略偏差。6e与6k的构象与内源配体ADN高度相似，三者均通过广泛的相互作用网络稳定占据结合口袋。

**MD模拟与RMSD结构偏差**　三个体系经600 ns全原子模拟，取末200 ns轨迹以0.05 nm RMSD截断进行GROMOS聚类以识别热力学稳定状态。受体主链RMSD在三个复合物中均稳定收敛于0.20–0.25 nm，表明受体构象良好平衡。ADN与6k的配体RMSD低而稳定，全程维持在约0.10 nm，说明二者保持初始结合构象并紧密锚定；6k在约20至约120 ns间出现轻微构象位移，随后稳定并维持一致结合姿态，平均RMSD约0.2 nm，提示其进入替代但稳定的构象；叠加分析显示ADN与6e与初始对接构象高度重合，6e空间重叠尤佳，6k质心略下移但未显著丧失与关键残基的接触。

**蛋白–配体相互作用指纹**　沿全轨迹的相互作用指纹分析表明，6e与6k与受体形成的接触数多于内源配体ADN，尤以疏水与vdW相互作用为著；这些单独较弱的相互作用通过加和稳定效应显著贡献结合亲和力，可解释US所见的强结合自由能。6e与6k与LEU250、VAL87、MET180、ILE274等残基形成广泛疏水接触，并与腔内残基保持稳定vdW作用；ADN因体积较小、非极性基团较少而接触较少。与PHE171的π堆积在三者中均保守，可能作为关键锚定点维持配体取向与稳定性，该作用在ADN与6e中更强，6k中亦持续出现。氢键模式上，ADN形成多重极性相互作用（如与TYR91、HIS251、HIS278），而合成配体将平衡转向更疏水与vdW驱动的结合，提示6e与6k在设计上旨在延长驻留时间并改善膜分配性质；时间分辨热图进一步支持合成配体形成更广泛、更持久的相互作用。

**US模拟**　基于MD聚类代表性结构进行伞形采样，沿膜法向逐步牵引配体并构建PMF曲线，以全局极小（结合态）与平台区（约3.5 nm，非结合态）之差计算ΔG。解离自由能为ADN ?45.78 kJ/mol、6e ?129.46 kJ/mol、6k ?88.46 kJ/mol，表明两种合成配体与A₁受体的结合显著强于内源腺苷，其中6e亲和力最强。该能量学结果与平衡MD中的相互作用模式高度一致：ProLIF分析显示6e与6k形成更多稳定的非共价相互作用，尤以vdW与疏水接触为多；与保守芳香残基P171的π–π堆积在所有配体轨迹中均高度持久，而在6e复合物中频率尤高。这种密集而协同的相互作用网络可能构成6e优越结合亲和力的基础，说明配体–受体结合强度不仅源于特定氢键，也源于大量弱疏水相互作用的集体贡献。

**ADMET观察**　以SwissADME与pkCSM进行计算机ADMET预测。所有化合物分子量为232.67–455.08 g/mol，处于类药理想范围；拓扑极性表面积（TPSA）均为43.08 ?²，利于被动跨膜扩散。6e与6k共识Log P_o/w分别为3.72与3.78，亲脂性平衡，兼具膜通透性与溶解度；6a–6c在多数模型中被判为“可溶”，6j与6l因长疏水链或大芳香表面被判“难溶”。多数化合物胃肠道吸收高并可透过血脑屏障，尤以6e、6g、6k为著，提示系统生物利用度与潜在中枢神经系统渗透；无一被预测为P-糖蛋白（P-gp）底物，降低外排介导耐药的概率；但6h与6i等被预测抑制CYP1A2、CYP2C19，6h更抑制全部所测CYP亚型，提示多药联用时的相互作用风险。多数化合物符合Lipinski、Ghose、Veber、Egan与Muegge规则，6e与6k无任何违规；生物利用度评分均为0.55；无PAINS或Brenk警示；合成可及性（SA）值2.39–4.21，6e与6k较低，支持其放大与进一步临床前评估。8j虽对接分数可接受，但溶解度差、分子量高，可行性受限。

**讨论总结**　平面喹喔啉核心与三唑连接单元及多种脂肪族或芳香族酸取代基的理性杂合，构建出具有显著生物学相关性的化学系列；该骨架融合具有新颖性，提供DNA嵌入潜力与受体结合能力兼具的双药效团活性，而这在小分子设计中鲜有同时优化。体外筛选显示6e、6g、6i、6k在三种细胞系中生长抑制最显著，MCF-7最敏感，可归因于其核DNA含量与雌激素受体表达较高，利于与平面嵌入型药物作用。对接结果与生物学发现相互印证，6k、6e、6i对腺苷A₁受体显示显著结合亲和力，并与ASN1359、PHE1346、VAL1302等稳定拮抗剂结合的关键残基持续作用。对接与ADMET的交叉验证进一步支持其药理潜力：6e、6g、6k理化性质优良、胃肠道吸收高、可透血脑屏障、无PAINS/Brenk警示，共识Log P_o/w约3.7–4.2，兼具膜穿透与溶解度；均非P-gp底物，规避外排耐药这一化疗关键障碍；部分衍生物抑制CYP1A2与CYP2C19的问题可通过结构优化调节选择性。本研究的意义在于以稳健的实验与计算关联，同时聚焦DNA与腺苷受体介导的通路；与通常单一机制起效的现有喹喔啉类似物相比，这些双模式分子具有交叉功能效力——6k借助肉桂基元的平面芳香性改善DNA相互作用与受体结合，6e则以优良亲脂性利于细胞摄取与滞留。研究确证喹喔啉–三唑框架为优异化学型，6e与6k为结构新颖、机制可塑的抗癌先导候选物。

**结论（译文）**　制备并表征了12个喹喔啉–1,2,4-三唑杂合体（6a–6l），涵盖链长递增的脂肪族系列及两个芳香变体。针对MCF-7、HeLa与HepG2细胞的筛选将6e与6k置于系列之首。二者均良好对接进入腺苷A₁受体，结合能分别为?9.02与?9.24 kcal/mol，600 ns MD模拟显示所得复合物在全轨迹中保持构象。US给出的结合自由能为6e ?129.46 kJ/mol、6k ?88.46 kJ/mol。二者的预测ADMET谱同样令人鼓舞，理化性质可接受、胃肠道吸收高且无类药性违规。综上，这些结果将6e与6k标记为值得从本系列中继续推进的候选物。A₁受体相互作用属对接与模拟结果而非实测结果，且尽管喹喔啉核心提示嵌入潜力，本研究未收集DNA结合数据。在可宣称任一化合物的靶标特异性、安全性或治疗相关性之前，尚需功能性受体实验、直接DNA结合测定、药代动力学分析与体内评价。