大戟甲醇提取物的光动力与细胞毒性评价：化学成分表征、分子对接及光激活抗癌活性研究

《Chemistry & Biodiversity》：Photodynamic and Cytotoxic Evaluation of Euphorbia anacampseros Methanolic Extract: Chemical Characterization, Molecular Docking, and Light-Activated Anticancer Activity

　　

本研究旨在利用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC–DAD）和气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析表征大戟（Euphorbia anacampseros）甲醇提取物的化学成分。研究人员采用MTT法评估提取物的细胞毒性活性，并评价其光增强细胞毒性效应，以探究其在未来光动力应用中的潜力。此外，研究人员进行了分子对接分析，以评估已鉴定化合物与胆色素原脱氨酶（PBGD）之间的相互作用。半数抑制浓度（IC50）值分别为：HT-29细胞系54.72 μg/mL，MCF-7细胞系50.34 μg/mL，A549细胞系58.97 μg/mL。在黑暗条件下，该提取物对所有受试细胞系表现出中等且非选择性的基线细胞毒性，IC50值范围为46.95至58.97 μg/mL。然而，经蓝光、绿光、黄光或红光照射后，该提取物对HT-29细胞的细胞毒性活性显著增强，提示其具有未来光动力应用的潜力。针对PBGD的分子对接分析显示，芦丁和表儿茶素表现出最高的结合亲和力，结合能分别为–9.9和–7.8 kcal/mol。这些发现表明，E. anacampseros的化学成分可能充当光敏剂，通过参与卟啉代谢相关酶的相互作用，潜在地增强光动力疗法的效果。

论文解读

一、研究背景与目的

癌症是一类以细胞不受控增殖、侵袭周围组织及向远处器官转移为特征的异质性疾病群。尽管近年来癌症治疗结局已有明显改善，但临床上仍亟需更有效、成本更低且副作用更小的治疗策略。与传统化疗影响肿瘤和健康细胞、放疗产生辐射相关破坏性效应不同，光动力疗法（PDT）作为一种替代性治疗策略日益受到重视。PDT通过光敏剂（PS）在光和分子氧存在下被激活，产生活性氧（ROS）介导细胞死亡机制。PDT的三个核心组分——光敏剂、光和分子氧——单独存在时均无毒性，但三者组合可导致细胞毒性ROS的形成。与传统治疗方式不同，光敏剂仅在应用部位扰乱细胞稳态，诱导程序性细胞死亡或坏死，因此具有局部选择性优势。

目前已鉴定出400余种潜在光敏剂。第一代光敏剂如血卟啉衍生物（HPD；photofrin、porfimer sodium）已用于膀胱癌、早期肺癌和食管癌的治疗，但存在组织穿透有限、化学异质性、光吸收能力低及生物学半衰期长等局限。第二代光敏剂如5-氨基乙酰丙酸（5-ALA，Levulan）和间-四(羟苯基)二氢卟吩（mTHPC；Foscan、temoporfin）改善了组织穿透能力并减少了副作用，但仍可能因毒性损伤健康组织且化学稳定性较低。第三代光敏剂如N-天冬氨酰二氢卟吩e6（NPe6；talaporfin sodium、laserphyrin）通过对第二代光敏剂进行抗体、氨基酸、碳水化合物或多肽等组分的缀合修饰，或将其封装入脂质体、纳米粒和胶束等载体系统而开发。

天然产物因其相比合成药物副作用更少或没有副作用，且支持环境友好的绿色策略，在PDT应用中受到广泛关注。含有生物活性化合物的药用植物被视为天然光敏剂的来源。大戟科（Euphorbiaceae）主要分布于全球热带和亚热带地区，包含317属6745个分类群。在大戟属（Euphorbia）物种中，仅约250种经过了化学和药理学研究。该属植物在中国、欧洲、美洲、土耳其、印度、非洲、伊朗和巴基斯坦等地有传统药用历史，其茎、叶、根和乳白色乳汁广泛用于治疗呼吸道感染、皮肤和身体刺激、消化系统疾病、炎症性疾病、全身疼痛及癌症。已有研究报道从大戟属物种中分离的某些二萜类化合物对多种癌症类型具有细胞毒性活性。然而，经文献检索，此前尚无针对E. anacampseros的研究。因此，本研究旨在评估E. anacampseros的细胞毒性效应及其用于PDT的潜力。

二、主要技术方法

研究人员从土耳其科尼亚-贝伊谢希尔公路沿线采集Euphorbia anacampseros Boiss. var. anacampseros标本，经甲醇浸提获得粗提物，提取率为7.73%（w/w）。采用两种HPLC–DAD方法对24种标准品进行定量分析，通过保留时间和DAD紫外光谱双重匹配确认化合物身份；采用顶空固相微萃取（SPME）结合GC–MS分析挥发性化合物，通过NIST谱库比对和保留指数（RI）双重验证进行化合物鉴定。细胞毒性评估使用人胚肾细胞HEK293、人结直肠腺癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549四种细胞系，采用MTT法测定细胞活力。光动力活性评估使用三面板LED系统，提供蓝光（423 nm）、绿光（532 nm）、黄光（583 nm）和红光（640 nm）四种波长照射。分子对接分析使用AutoDock Vina 1.2.5软件，以人胆色素原脱氨酶（PBGD；PDB ID: 3ECR）为靶蛋白，通过共晶配体再对接验证方案可靠性（RMSD = 1.05 ?）。

三、研究结果

3.1 HPLC基植物化学特征分析

HPLC分析揭示了E. anacampseros提取物中存在多种生物活性化合物，包括维生素C、酚酸和类黄酮。L-抗坏血酸检测浓度最高（7460.1 mg/L），提示其具有较强的抗氧化能力。酚酸中，邻苯三酚（1387.3 mg/L）、香草酸（780.1 mg/L）和没食子酸（320.3 mg/L）含量最为丰富，其次为绿原酸（201.2 mg/L）、对香豆酸（108.3 mg/L）、反式咖啡酸（106.3 mg/L）、迷迭香酸（34.9 mg/L）和阿魏酸（1.8 mg/L）。类黄酮中，芦丁（4664.5 mg/L）、（–）-表儿茶素（2296.1 mg/L）和（+）-儿茶素（1265.9 mg/L）以相对较高浓度被鉴定，另有槲皮素（76.2 mg/L）和黄芩素（34.2 mg/L）。这些发现表明E. anacampseros具有富含酚类化合物的植物化学特征，可能对其生物活性有所贡献。

3.2 GC–MS挥发性化合物分析

GC–MS分析共鉴定出8种挥发性化合物。含量最高的为己醛（25.527%），其他鉴定化合物包括（E）-2-己烯醛（17.652%）、2,4,6-辛三烯醛（17.257%）、苯甲醛（12.426%）、甲基庚烯酮（9.750%）、对伞花烃（8.382%）、β-蒎烯（5.951%）和异枯茗（3.055%）。

3.3 抗癌活性与光动力疗法

在黑暗条件下，E. anacampseros甲醇提取物表现出中等基线细胞毒性。IC₅₀值分别为：HEK293为46.95 μg/mL，HT-29为54.72 μg/mL，MCF-7为50.34 μg/mL，A549为58.97 μg/mL。单因素方差分析显示这些基线IC₅₀值之间的差异无统计学显著性（p > 0.05），表明该提取物在无光激活条件下缺乏固有的生物学选择性。

光动力活性评估显示，E. anacampseros提取物与不同波长光照射（蓝、绿、黄、红）联合使用时，在HEK293（正常）和HT-29（结直肠癌）细胞系中的光动力效力均显著增强。与对照组相比，所有光照组的IC₅₀值均显著降低，表明提取物的细胞毒性效应通过光激活得到增强。在HEK293细胞中，红光处理产生最低IC₅₀值（110.6 μg/mL），表明细胞毒性效应最强；绿光、黄光和蓝光处理也表现出细胞毒性活性，IC₅₀值分别为128.8、149.2和161.7 μg/mL。在HT-29细胞中，与黄光联合使用产生最显著的细胞毒性效应，IC₅₀值为194.3 μg/mL；绿光、红光和蓝光处理也表现出细胞毒性，IC₅₀值分别为222.2、253.6和281.8 μg/mL。尽管各波长间存在统计学显著差异，但这些差异不被认为具有实质性生物学意义。

根据计算的IC₅₀值，黑暗条件下选择性指数（SI）为0.86；黄光照射下（HT-29细胞中产生最高细胞毒性效应），SI为0.77。这些数值表明粗甲醇提取物目前缺乏对受试腺癌细胞系的固有生物学选择性。研究人员指出，PDT的临床相关性不仅依赖于生物学选择性，还依赖于空间选择性——细胞毒性效应严格局限于光照射区域。对于胃肠道癌症，可利用先进的内镜技术将光精确递送至肿瘤部位，从而在低SI情况下仍能最大限度地减少对周围健康组织的损伤。

3.4 分子对接结合亲和力与抑制潜力

分子对接模拟评估了E. anacampseros提取物中选定化合物与人胆色素原脱氨酶（PBGD；PDB ID: 3ECR）的相互作用潜力。在所测试分子中，芦丁表现出最强结合亲和力，结合能为–9.9 kcal/mol，其次为表儿茶素（–7.8 kcal/mol）和抗坏血酸（–5.3 kcal/mol）。相比之下，醛类化合物己醛（–3.8 kcal/mol）、（E）-2-己烯醛（–4.1 kcal/mol）和2,4,6-辛三烯醛（–4.8 kcal/mol）表现出相对较弱的结合亲和力。配体效率（LE）值范围为0.230（芦丁）至0.585（（E）-2-己烯醛），而拟合质量（FQ）值介于0.199至0.868之间。尽管芦丁的LE值最低，但其FQ值最高且结合能最优，表明其在结合亲和力与分子大小之间实现了最佳平衡。

分子相互作用分析显示，芦丁与靶蛋白形成多种氢键相互作用，涉及HIS210、ARG249、GLU89、GLU85、SER78、GLU120、ASN121和PRO122等残基；同时与TYR62（两种π–π堆积构象）、HIS123、HIS210和PHE200发生π–π相互作用，与ASP43发生π–阴离子相互作用，以及与PRO109、PRO108、PRO211、ILE208和LYS82发生疏水相互作用。表儿茶素与SER78、GLU89、ILE208和LEU79形成常规和C–H型氢键，与GLU85发生π–阴离子接触，与HIS123发生T型π–π相互作用，并与LYS82、PRO108、HIS123和ILE208发生烷基和π–烷基疏水相互作用。

四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出，尽管Lumnitzera racemosa（11.63 μg/mL）和Albizia procera（10.73 μg/mL）报道的IC₅₀值显著低于本研究E. anacampseros的观测值，但直接定量比较应谨慎解读，因为使用了不同的植物物种、提取方法、细胞模型、照射参数和实验方案。研究还引证了芦丁-镓复合物在抗菌光动力疗法中诱导细胞内ROS水平显著升高、儿茶素增强锌酞菁介导的A549肺癌细胞PDT效应、以及Dicoma anomala提取物增强酞菁介导的MCF-7乳腺癌细胞光动力效应等前期研究，支持植物来源的植物化学组分可能贡献于光依赖性抗癌活性。

研究人员承认本研究存在若干局限性：未进行细胞内ROS测量和其他机制性检测，因此尽管提取物表现出波长依赖性光增强细胞毒性，但确切分子机制尚未得到实验证实；缺乏临床确立的光敏剂作为阳性对照，限制了对观察到的光增强细胞毒性效应与现有光动力药物进行直接比较。未来研究应纳入参考光敏剂（如5-ALA、photofrin或chlorin e6），以促进对提取物光动力潜力的比较评估。

研究结论指出，E. anacampseros甲醇提取物对HT-29癌细胞表现出波长依赖性光增强细胞毒性。植物化学表征鉴定出22种化学成分，而分子对接分析表明芦丁和表儿茶素对PBGD表现出有利的结合亲和力，提示这些化合物可能是PDT疗效的潜在贡献者。尽管提取物单独使用仅表现出有限的细胞毒性活性，但光照射显著增强了其细胞毒性效应。虽然提取物表现出有效的光增强细胞毒性，但正常细胞与癌细胞之间的低SI凸显了靶向应用策略的必要性。这些发现表明E. anacampseros是光活性化合物的潜在来源，但需要进一步纯化和机制验证以改善其治疗特性。此外，活性化合物的分离、对接预测的生物学验证以及后续体内研究对于进一步探索其治疗潜力是必要的。