cMet抑制剂促进移植肝干细胞/祖细胞在肝硬化中的存活与长期疗效

《Stem Cells International》：A cMet Inhibitor Promotes the Survival and Long-Term Efficacy of Transplanted Hepatic Stem/Progenitor Cells in Liver Cirrhosis

背景：移植干细胞在肝硬化微环境（LCM）中存活率低，严重削弱其长期疗效，其机制至今不明。本研究探讨了一种小分子肽类化合物（icMet）经静脉给药抑制cMet受体，在二乙基亚硝胺（DEN）诱导的中晚期肝硬化阶段（CLS8/9）的作用，重点关注凋亡预防、内源性肝再生以及移植肝干细胞/祖细胞（MLpvNG2细胞）的长期疗效。 方法：以CLS8/9肝损伤的C57BL/6小鼠为受体。在MLpvNG2细胞治疗前或治疗期间使用icMet。同时利用CLS8/9肝组织制备条件培养基（CM，CLS8/9CM），观察MLpvNG2细胞对损伤肝脏相关信号的响应。结果：与未使用icMet的CLS8/9小鼠相比，icMet给药组小鼠移植MLpvNG2细胞在CLS8/9肝脏中的存活率显著提高，下游肝修复和长期愈合能力增强。在CLS8/9CM培养体系中，icMet处理组MLpvNG2细胞的存活情况与CLS8/9肝脏中观察到的结果相似。在机制层面，icMet预处理可能促进移植MLpvNG2细胞增殖并防止其凋亡，激活宿主肝脏功能性分化，尤其是窦状隙重建，从而启动肝细胞再生。此外，纤维化负荷的减轻也有利于供体细胞的再定植，从而实现长期治疗效果。 结论：在细胞治疗前或治疗期间阻断cMet受体的策略，可使移植MLpvNG2细胞在LCM中获得抗凋亡能力，并促进内源性肝再生，从而实现长期治疗效果。

论文解读

一、研究背景与目的

肝硬化（LC）是慢性肝损伤的终末病理结局，以过度纤维化瘢痕形成和实质结节包裹为特征，可导致肝组织结构重塑和功能衰竭。目前肝移植是终末期肝病的唯一根治手段，但供体器官严重短缺极大地限制了其临床应用。干细胞治疗，尤其是间充质干细胞（MSCs）和肝干细胞/祖细胞（HSPs）移植，被视为弥补器官短缺、替代肝移植的新兴策略。研究人员前期已鉴定MLpvNG2细胞为具有间充质干细胞样特征的HSPs，并在DEN诱导的早期肝硬化小鼠模型中证实其通过直接肝功能性分化、免疫调节和肝保护性细胞因子分泌发挥显著治疗作用。

然而，干细胞移植面临的核心瓶颈在于：移植细胞在肝硬化微环境（LCM）中大量凋亡，滞留率极低，严重制约长期疗效。研究人员前期发现，内源性HSPs（eNG2细胞）在DEN诱导的炎症性纤维化期（FLS_3–6）可存活，但在肝硬化期（CLS_7–10）发生大量凋亡，机制不明。主流理论认为，移植干细胞遭遇超出其耐受阈值的病理应激后进入不可逆细胞死亡程序。因此，如何提高移植干细胞在LCM中的存活率，是优化干细胞治疗肝硬化效果的关键科学问题。

本研究旨在探索一种不涉及潜在有害病毒载体的小分子肽类cMet受体抑制剂（icMet），在DEN诱导中晚期肝硬化阶段（CLS_8/9）于MLpvNG2细胞移植前或移植期间给药，观察其对移植细胞凋亡的预防作用、对内源性肝再生的促进作用以及对长期疗效的影响，并阐释可能的作用机制。

二、主要技术方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：（1）DEN诱导小鼠肝纤维化/肝硬化模型，通过饮水给予DEN持续12周，分别获取纤维化期（FLS_3/4）和中晚期肝硬化期（CLS_8/9）组织；（2）采用Percoll-Plate-Wait程序（PPWP）从成年小鼠肝脏分离纯化MLpvNG2细胞，纯度达95%–98%；（3）CFSE或RedCM-DiI（RedDye）标记细胞并经尾静脉移植；（4）制备不同肝损伤阶段的肝脏条件培养基（CM）进行体外共培养实验；（5）免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC）染色检测Ki-67、ALB、G6Pc、CK19、α-SMA、LYVE-1、Fas、cMet、caspase-8及磷酸化酪氨酸（pTyr）等标志物；（6）TUNEL凋亡检测；（7）Boyden小室迁移实验和划痕愈合实验；（8）免疫共沉淀（Co-IP）检测cMet–Fas复合物；（9）免疫印迹（Western blotting）检测HGF、Fas、FADD、caspase-8、caspase-3等蛋白表达；（10）qRT-PCR检测hgf、krt19、alb、g6Pc、lyve1、acta2等基因mRNA水平；（11）血清生化分析检测ALB、ALT、AST、LDL、TBiL、DBiL等肝功能指标。此外，研究还使用了来自陆军军医大学病理科生物样本库的人肝硬化及血管瘤组织样本（各n=3）进行初步验证。

三、研究结果

3.1 不同DEN肝损伤时程中移植MLpvNG2细胞存活率的差异

研究人员将MLpvNG2细胞分别移植入FLS_3/4和CLS_8/9小鼠肝脏，发现CLS_8/9肝脏中移植细胞数量显著低于FLS_3/4组，约减少2.5倍；Ki-67⁺增殖细胞比例在CLS_8/9组仅33.02%±12.79%，远低于FLS_3/4组的67.46%±16.02%；而TUNEL⁺凋亡细胞比例在CLS_8/9组高达约77%，FLS_3/4组仅约12%。结果表明移植MLpvNG2细胞在炎症性纤维化期可存活，但在肝硬化期滞留极差。

3.2 MLpvNG2细胞对不同肝损伤信号的迁移能力差异

体外培养实验显示，FLS_3/4CM培养中MLpvNG2细胞集落形成能力增强，而CLS_8/9CM培养中凋亡样细胞显著增多、集落形成明显减少。Boyden小室迁移实验和划痕愈合实验均证实，细胞向CLS_8/9CM的迁移能力显著低于FLS_3/4CM组。这些结果表明肝硬化微环境信号对MLpvNG2细胞存活不利。

3.3 肝硬化期HGF水平显著高于纤维化期

IHC、Western blotting和qRT-PCR一致证实CLS_8/9肝脏中HGF表达显著高于FLS_3/4肝脏。IHC双染分析显示HGF水平与内源性eNG2细胞数量呈显著负相关（R2=0.7850，p<0.0001）。人肝硬化样本中也观察到类似现象：NG2⁺细胞显著减少而TUNEL⁺凋亡细胞显著增多。这些发现提示肝硬化肝脏中过量的HGF可能是诱导肝干细胞凋亡的主要病理因素。

3.4 HGF蛋白以剂量依赖方式直接影响MLpvNG2细胞存活

将健康MLpvNG2细胞直接暴露于不同浓度重组HGF（rHGF）蛋白，发现低浓度（1、5 ng/mL）促进细胞增殖和集落形成，Ki-67⁺细胞比例显著升高；而高浓度（150、300 ng/mL）则诱导大量凋亡样细胞出现，Ki-67⁺细胞显著减少，TUNEL染色显著增强。该结果证实HGF对MLpvNG2细胞具有剂量依赖的双重作用。

3.5 cMet抑制剂预处理防止移植MLpvNG2细胞凋亡并促进功能恢复

在CLS_8/9阶段给予icMet预处理后移植MLpvNG2细胞（icMet+NG2-3d），72小时内移植细胞在肝脏中的滞留量显著高于未用icMet组（NG2-3d）。icMet+NG2-3d组中Ki-67⁺移植细胞比例超过29%，约为NG2-3d组（<7%）的4倍，且移植细胞的增殖能力显著优于宿主内源性细胞。血清肝功能检测显示，icMet+NG2-3d组ALT、AST、LDL、TBiL、DBiL水平较NG2-3d组显著改善。此外，icMet+NG2-3d组α-SMA⁺活化肝星状细胞显著减少，CK19⁺胆管细胞数量约为NG2-3d组的4倍，LYVE-1⁺肝窦内皮细胞也显著增多，提示胆管树和窦状隙结构重建启动。

3.6 icMet预处理策略促进失代偿性肝硬化模型中的肝细胞再生与功能维持

比较icMet+NG2-3d与icMet+NG2-4wk两组，4周组G6Pc⁺和ALB⁺肝细胞数量显著增多，qRT-PCR结果一致。血清ALB水平在4周组显著改善，与正常对照组无显著差异（p=0.111）。与仅细胞治疗4周组（NG2-4wk）相比，icMet+NG2-4wk组AST、TBiL、DBiL显著降低，LDL显著升高。α-SMA⁺细胞在4周组显著减少，纤维化负荷明显减轻。

3.7 MLpvNG2细胞的高效存活与宿主胆管和窦状隙长期再生支持4周疗效

与icMet+NG2-3d组相比，icMet+NG2-4wk组中Ki-67⁺移植细胞比例显著升高，TUNEL⁺凋亡细胞显著减少，CK19⁺胆管细胞和LYVE-1⁺肝窦内皮细胞均显著增多，krt19和lyve-1 mRNA表达趋势一致。结果表明icMet辅助下MLpvNG2细胞可在LCM中存活至4周观察期，持续促进宿主胆管树和窦状隙结构重建。

3.8 cMet预抑制通过阻断Fas介导的凋亡并刺激MLpvNG2细胞增殖

体外共培养实验中，CLS_8/9CM诱导MLpvNG2细胞出现明显凋亡样形态，而icMet预处理24小时的细胞形态恢复正常。IF和Western blotting检测显示，icMet预处理显著降低Fas、TUNEL、caspase-8、FADD、caspase-3等凋亡标志物的表达。高浓度rHGF（200 ng/mL）诱导的凋亡同样由Fas介导。Co-IP实验证实健康MLpvNG2细胞中天然存在cMet–Fas复合物。此外，icMet预处理组中pTyr⁺/cMetβ⁺双阳性细胞比例达69.88%±12.01%，约为未处理组（28.87%±11.59%）的3倍，表明cMet抑制在防止凋亡的同时刺激了细胞增殖。

四、讨论与结论

本研究针对干细胞移植治疗肝硬化中移植细胞在LCM中大量凋亡这一核心瓶颈，提出了一种创新性策略：在细胞移植前或移植期间使用小分子肽类化合物icMet阻断cMet受体。研究证实，肝硬化期过量的HGF应激是诱导移植MLpvNG2细胞Fas介导凋亡的关键病理因素，而icMet预处理可有效防止移植细胞凋亡、促进其增殖，并通过激活宿主胆管树重建和窦状隙结构重建，启动肝细胞再生，最终实现4周的长期功能恢复。

该策略的优势在于：其一，icMet为小分子化合物，不涉及潜在有害的病毒载体，具有良好的临床转化前景；其二，cMet抑制不仅直接保护移植细胞，还可能通过重塑肝硬化微环境、减轻纤维化负荷（α-SMA减少）、减少HGF分泌，间接促进移植细胞的再定植；其三，存活供体细胞通过直接功能性分化（CK19、ALB、G6Pc）和旁分泌机制激活宿主再生潜能（LYVE-1、CK19），实现协同治疗效应。

研究结论：在细胞治疗前或治疗期间阻断cMet受体的策略，可使移植MLpvNG2细胞在LCM中获得抗凋亡能力并促进内源性肝再生，从而实现长期治疗效果。该策略可能同样适用于肝细胞、HSPs及MSCs等其他类型移植细胞的存活优化，为干细胞治疗肝硬化的临床转化提供了重要的理论依据和可行方案。