ACTH-SF1/NR5A1-NRF2轴通过线粒体ROS积累介导糖皮质激素诱导的肾上腺皮质细胞死亡

《Cell Death & Disease》：Role of the ACTH-SF1/NR5A1-NRF2 axis in glucocorticoid-induced adrenocortical cell death through mitochondrial ROS accumulation

　　

外源性糖皮质激素被广泛用于治疗炎症性和自身免疫性疾病，然而长期给药常导致肾上腺皮质萎缩并继发肾上腺功能不全。然而，糖皮质激素诱导的肾上腺皮质萎缩的分子机制仍未完全阐明。本研究中，研究人员表明，地塞米松（DEX）处理小鼠的肾上腺皮质改变与人类皮质醇分泌腺瘤邻近的肾上腺皮质组织相似。在DEX处理期间，发生明显的细胞死亡，且局限于肾上腺皮质束状带（ZF），这是由活性氧（ROS）介导的线粒体功能障碍所致；这些病理改变均可通过联合给予促肾上腺皮质激素（ACTH）而减轻。在DEX处理的小鼠中，ACTH缺乏损害ZF细胞中核因子E2相关因子2（NRF2）依赖性氧化还原稳态。激活cAMP-PKA信号通路（ACTH刺激的下游信号）可增加体外培养的肾上腺皮质细胞中类固醇生成因子1（SF1；NR5A1）的基因表达，SF1直接结合Nrf2启动子并增强其转录，从而促进抗氧化基因表达以维持氧化还原稳态。本研究揭示了ACTH-SF1-NRF2轴在糖皮质激素通过线粒体ROS积累诱导的肾上腺皮质细胞死亡中的作用，从而为预防或治疗糖皮质激素过量期间的继发性肾上腺功能不全提供了新治疗策略的线索。

ACTH-SF1/NR5A1-NRF2轴通过线粒体ROS积累介导糖皮质激素诱导的肾上腺皮质细胞死亡

一、研究背景与问题

肾上腺皮质是机体应激反应整合的关键器官，在人类中由外向内分为球状带（ZG）、束状带（ZF）和网状带（ZR），分别分泌盐皮质激素（醛固酮）、糖皮质激素（皮质醇）和肾上腺雄激素。内源性糖皮质激素的分泌受到垂体来源的促肾上腺皮质激素（ACTH）的严格调控，而ACTH的生成又受下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素的刺激。糖皮质激素因其强大的抗炎和抗过敏特性，被广泛用于治疗自身免疫性疾病、过敏性疾病甚至癌症。然而，长期使用糖皮质激素会通过负反馈抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致内源性糖皮质激素分泌减少，最终引起继发性肾上腺功能不全。类似地，在皮质醇分泌性肾上腺皮质腺瘤（CPA）患者中，垂体ACTH分泌被负反馈机制抑制，伴随CPA邻近非肿瘤组织以及对侧肾上腺组织萎缩，常导致肿瘤切除后出现继发性肾上腺功能不全。

尽管继发性肾上腺功能不全中萎缩肾上腺皮质的功能恢复需要相当长的时间，构成重大临床挑战，常需糖皮质激素替代治疗，但人类肾上腺皮质组织难以获取，因此关于糖皮质激素过量时肾上腺皮质如何萎缩和功能恶化，以及如何有效恢复甚至预防，研究尚不充分。尽管肾上腺皮质生物学存在显著物种差异，小鼠等啮齿动物提供了独特的实验模型系统，可用于研究糖皮质激素过量期间肾上腺皮质功能和结构改变的机制。

线粒体参与多种生物过程，线粒体活性氧（ROS）积累可损伤线粒体DNA、降低线粒体膜电位，导致细胞色素c释放并启动凋亡通路。尽管已知糖皮质激素过量会加重肾上腺皮质细胞凋亡，但线粒体ROS积累是否参与糖皮质激素诱导的肾上腺皮质细胞死亡，以及其如何诱导细胞死亡，此前尚未明确。本研究旨在阐明这一机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员用地塞米松（DEX）处理小鼠，观察到肾上腺皮质萎缩特异性地发生在ZF。ZF细胞出现线粒体功能障碍并发生ROS依赖性细胞死亡。联合给予ACTH可逆转这些病理生理改变，ACTH恢复核因子E2相关因子2（NRF2）依赖性抗氧化合成，维持肾上腺皮质细胞氧化还原稳态。进一步研究发现，类固醇生成因子1（SF1；NR5A1）——一种关键的类固醇生成转录因子——在ACTH刺激下表达增强，并直接增加Nrf2表达。该研究揭示了ACTH-SF1-NRF2轴在糖皮质激素通过线粒体ROS积累诱导的ZF细胞死亡中的作用，为预防或治疗糖皮质激素过量期间的继发性肾上腺功能不全提供了新治疗策略线索。论文发表在《Cell Death 》。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键方法：动物模型采用C57BL/6J小鼠，通过皮下植入微渗透泵持续给予DEX，并设置ACTH联合给药、NAC抗氧化剂和ferrostatin-1铁死亡抑制剂处理；通过组织学（HE染色、免疫组织化学IHC、TUNEL染色）评估肾上腺形态和细胞死亡；利用批量RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析转录组变化；使用Seahorse XFe24分析仪测量原代肾上腺细胞的耗氧率（OCR）；用透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构；用流式细胞术检测MitoSOX Red标记的线粒体ROS水平；在体外小鼠肾上腺皮质细胞系Y1中使用forskolin（FSK）和H-89分别激活和抑制cAMP-PKA通路，并通过siRNA敲低和过表达SF1研究其功能。人类样本包括CPA邻近肾上腺组织和NFT邻近组织，并分析了已发表的RNA-seq数据集（E-MTAB-13109）。

四、研究结果

1. DEX诱导的小鼠肾上腺皮质改变
DEX处理显著降低小鼠肾上腺重量，萎缩局限于ZF；类固醇生成基因（Star、Cyp11a1、Cyp11b1）表达显著下调。RNA-seq显示DEX处理后线粒体和类固醇生成通路下调，而炎症、巨噬细胞迁移和凋亡细胞清除通路上调。IHC显示ZF中CC3阳性凋亡细胞和CD68阳性巨噬细胞增加。雌鼠也出现类似但较轻微的改变。

2. 慢性糖皮质激素过量患者的肾上腺皮质改变
人类CPA邻近肾上腺皮质组织中，ZF显著萎缩，TUNEL阳性死亡细胞增加并伴有大量巨噬细胞浸润。转录组分析显示CPA组巨噬细胞浸润、凋亡和吞噬相关基因上调，类固醇生成和线粒体功能相关基因下调。

3. DEX处理小鼠ZF细胞的线粒体功能障碍
GSEA显示线粒体相关通路与DEX处理呈负相关；线粒体复合物基因（Cox1、Cox2）表达降低。TEM显示DEX处理后ZF细胞线粒体数量减少、体积缩小，出现嵴畸形和低密度区室等异常超微结构，而ZG细胞线粒体不受影响。原代肾上腺细胞OCR在DEX处理3天后受损。未检测到内质网应激反应。

4. DEX处理小鼠肾上腺皮质中ROS依赖性细胞死亡
MitoSOX Red染色显示DEX处理后原代肾上腺细胞线粒体ROS时间依赖性积累。ROS清除剂NAC降低了ROS积累，改善了线粒体形态异常，恢复了肾上腺重量，减轻了ZF萎缩、细胞死亡和巨噬细胞浸润。

5. 铁死亡对DEX诱导肾上腺皮质细胞死亡的贡献有限
DEX处理未增加脂质过氧化或Fe2?/Fe3?水平；铁死亡抑制剂ferrostatin-1未能显著减轻凋亡、类固醇生成抑制或巨噬细胞浸润。PI/CC3共染显示大多数死亡细胞为CC3阳性，提示凋亡是主要死亡形式。

6. DEX处理后ZF细胞中NRF2依赖性氧化还原稳态下调
scRNA-seq鉴定出对DEX最敏感的ZF亚群（cluster 2），该亚群线粒体复合物基因表达最低，cAMP-PKA通路、谷胱甘肽代谢和氧化应激反应通路下调。TRRUST分析预测SP1和NRF2转录因子活性降低。

7. ACTH联合给药减轻DEX诱导的肾上腺皮质改变
短期ACTH给药后，肾上腺中抗氧化基因（Gpx4、Nrf2）表达上调，氧化还原稳态通路激活。DEX联合ACTH可减少ROS积累，恢复GSH/GSSG比值，改善线粒体形态，恢复肾上腺重量，减轻ZF萎缩、细胞死亡和巨噬细胞浸润。

8. 体外ACTH-SF1-NRF2轴促进抗氧化酶表达
在Y1细胞中，H-89抑制PKA后降低Nrf2和Gpx4表达，诱导ROS积累并降低GSH/GSSG比值；FSK激活cAMP-PKA后增加类固醇生成和抗氧化基因表达，下调KEAP1蛋白，诱导NRF2核转位。FSK上调Sf1表达，H-89下调；Sf1敲低降低抗氧化酶表达，过表达则增强。SF1结合基序存在于Nrf2基因内含子区域，公共ChIP-seq数据显示cAMP刺激后在Nrf2内含子区有SF1结合峰。

五、讨论与结论

讨论部分指出，DEX诱导的肾上腺病理主要源于ACTH信号丧失而非DEX对糖皮质激素受体（GR）的直接激活，因为肾上腺皮质细胞中GR基因Nr3c1表达较低，且ACTH联合给药具有保护作用。DEX诱导的肾上腺萎缩在雌鼠中较轻，可能涉及肾上腺固有的性别二态性。线粒体功能障碍相关凋亡是多种疾病的重要触发因素，NAC有效逆转DEX诱导的改变支持ROS依赖性细胞死亡机制。铁死亡在该模型中贡献有限，但不能完全排除。本研究首次揭示SF1在类固醇生成器官中作为氧化应激反应调节因子的新作用，SF1连接cAMP-PKA信号通路与Nrf2表达。

研究结论：研究人员证明，DEX处理导致的ACTH缺乏通过下调抗氧化酶引起肾上腺皮质细胞ROS积累和线粒体功能障碍，最终导致细胞死亡。本研究首次证明转录因子SF1作为ACTH-cAMP-PKA信号通路下游因子促进Nrf2表达，从而激活抗氧化基因以保护肾上腺皮质细胞免受氧化应激。数据表明，抗氧化策略为预防或治疗糖皮质激素过量期间的继发性肾上腺功能不全提供了新治疗策略的线索。