《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：γ-T3 Increases the Sensitization of Gastric Cancer Cells to OXA by a Regulation of ARHGAP29
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γ-生育三烯酚（γ-T3）在体外和体内均表现出强效抗癌作用。研究人员前期研究证实，γ-T3通过GSK-3β/β-Catenin通路调节胃癌（GC）细胞自噬活性。本研究进一步探讨γ-T3是否也通过调控ARHGAP29增强GC细胞对奥沙利铂（OXA）的化疗敏感性，
γ-生育三烯酚（γ-T3）在体外和体内均表现出强效抗癌作用。研究人员前期研究证实，γ-T3通过GSK-3β/β-Catenin通路调节胃癌（GC）细胞自噬活性。本研究进一步探讨γ-T3是否也通过调控ARHGAP29增强GC细胞对奥沙利铂（OXA）的化疗敏感性，并验证γ-T3与ARHGAP29的直接结合以及ARHGAP29与GSK-3β的物理相互作用。研究人员采用细胞活力实验、流式细胞术、肿瘤细胞球形成实验、逆转录定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）分析和稳定过表达转染。此外，进行细胞热位移实验（CETSA）、免疫共沉淀（Co-IP）和氯喹（CQ）挽救CCK-8实验以验证分子相互作用和自噬功能；研究人员使用MKN45细胞在BALB/c裸鼠（nu/nu）中建立异种移植肿瘤模型。γ-T3和OXA在体外和体内均抑制GC细胞增殖，联合应用具有协同效应（MKN45细胞中联合指数（CI）=0.55）。在小鼠模型中，腹腔注射γ-T3（20 mg/kg b.w.）和OXA（2.0 mg/kg b.w.）抑制MKN45细胞异种移植瘤生长。这与细胞周期阻滞和癌症干细胞（CSCs）抑制有关。γ-T3单药或联合OXA处理48 h后改变自噬相关蛋白水平，LC3-II/LC3-I比值和Beclin1表达升高，p62丰度降低；使用自噬抑制剂CQ进行功能挽救证实，改变的自噬参与药物诱导的细胞死亡，且该表型变化伴随GSK-3β/β-Catenin通路活性受抑。ARHGAP29与GC预后呈负相关；CETSA结果验证γ-T3与ARHGAP29在细胞内的直接结合，Co-IP实验证实ARHGAP29与GSK-3β的物理相互作用。无论单药还是与OXA联用，γ-T3均以时间和剂量依赖方式抑制ARHGAP29的蛋白和mRNA表达。ARHGAP29过表达逆转γ-T3与OXA在GC细胞中的协同效应，进一步支持ARHGAP29与GSK-3β/β-Catenin轴之间的调控联系。γ-T3与OXA联合是一种有前景的治疗策略，可提高GC中奥沙利铂敏感性并改变自噬相关标志物表达，至少部分通过ARHGAP29相关的GSK-3β/β-Catenin信号调节实现。
研究背景与问题：胃癌（GC）全球死亡率较高，晚期患者总体生存率有限，奥沙利铂（OXA）长期应用易出现化疗耐药和不良反应，因此提高肿瘤化疗敏感性并寻找新靶点具有临床意义。植物化学物中，γ-生育三烯酚（γ-T3）具有抗炎、免疫调节和抗肿瘤作用，既往研究显示其可单药抑制GC细胞增殖并调节自噬，且与GSK-3β/β-Catenin通路相关。ARHGAP29（Rho GTP酶激活蛋白29，别名PARG1）与肿瘤进展、侵袭及预后相关，但γ-T3是否通过ARHGAP29增强OXA敏感性、ARHGAP29是否与GSK-3β存在物理互作尚需验证。研究人员因此开展体外与体内研究，验证γ-T3联合OXA的协同抗GC作用及其经ARHGAP29/GSK-3β/β-Catenin通路调控自噬的机制。研究结论支持γ-T3联合低剂量OXA可协同抑制GC并诱导自噬依赖性细胞死亡，部分通过下调ARHGAP29及抑制GSK-3β/β-Catenin信号实现，为GC增敏治疗提供了潜在策略和靶点。
关键技术方法（≤250字）：研究人员使用人胃癌MKN45、AGS细胞及正常胃上皮GES-1细胞；以MTT和MB法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期，肿瘤细胞球形成实验评估干细胞样特性，RT-qPCR和Western blot检测基因与蛋白表达，并进行稳定过表达转染。采用细胞热位移实验（CETSA）验证γ-T3与ARHGAP29直接结合，免疫共沉淀（Co-IP）验证ARHGAP29与GSK-3β物理互作，氯喹（CQ）挽救CCK-8实验验证自噬功能。体内建立BALB/c裸鼠（nu/nu）MKN45细胞异种移植模型，腹腔注射γ-T3（20 mg/kg b.w.）和OXA（2.0 mg/kg b.w.）。利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库胃腺癌（STAD）数据集分析ARHGAP29表达与预后。
研究结果：
3.1 γ-T3和OXA抑制胃癌（GC）细胞增殖：通过MTT和MB实验发现，γ-T3或OXA均以时间-剂量依赖方式降低MKN45和AGS细胞活力；联合处理较单药进一步降低细胞活力，MKN45和AGS的CI分别为0.55和0.59，提示协同作用；肿瘤细胞球形成实验显示联合处理对MKN45细胞球数量和大小抑制更强；联合处理对GES-1细胞活力无明显影响。
3.2 γ-T3+OXA抑制MKN45细胞异种移植瘤生长：通过BALB/c裸鼠MKN45异种移植模型发现，各组体重无显著波动；γ-T3或OXA单药抑制移植瘤生长，联合组肿瘤重量和体积最低；HE染色显示联合组肿瘤异质性降低、淋巴细胞浸润和坏死区增加更明显；免疫组织化学（IHC）显示联合组增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞减少。
3.3 γ-T3+OXA阻滞胃癌细胞周期分布：通过流式细胞术发现，γ-T3单药使MKN45细胞阻滞于G0/G1期，OXA单药或联合使MKN45细胞S期比例由（28.24±0.01）%升至（35.58±0.01）%；AGS细胞中联合处理引起G2/M期阻滞。
3.4 γ-T3+OXA改变胃癌细胞自噬相关标志物表达：通过Western blot时程检测发现，处理48 h时自噬相关蛋白变化最明显，LC3-II/LC3-I比值升高、Beclin1表达上调、p62丰度降低，联合处理变化强于单药，异种移植瘤中结果一致；免疫荧光（IF）显示联合组胞质LC3荧光增强，Beclin1与p62存在共定位；CQ挽救CCK-8实验显示CQ逆转联合处理所致活力下降，证实改变的自噬促进GC细胞死亡。
3.5 γ-T3+OXA抑制胃癌细胞ARHGAP29表达并抑制GSK-3β/β-Catenin信号活性：通过TCGA STAD数据及Kaplan-Meier分析发现，ARHGAP29在GC组织高表达，与较差总生存和临床分期进展相关；分子对接显示ARHGAP29与γ-T3结合能为?7.5 kcal/mol；CETSA验证γ-T3处理提高ARHGAP29热稳定性，支持直接结合；双向Co-IP验证ARHGAP29与GSK-3β物理互作；Western blot和RT-qPCR显示γ-T3以时间、剂量依赖方式抑制ARHGAP29蛋白和mRNA表达，联合处理在细胞和移植瘤中抑制更明显，IHC结果一致；联合处理降低p-GSK-3β（Ser9）和β-Catenin表达。
3.6 ARHGAP29过表达减弱γ-T3+OXA对胃癌细胞增殖的协同抗增殖作用：通过慢病毒Flag-ARHGAP29过表达MKN45细胞并结合MTT、MB实验发现，过表达ARHGAP29提高联合处理下细胞活力，减弱γ-T3+OXA的协同抗增殖作用；Western blot显示ARHGAP29过表达逆转联合处理对p-GSK-3β和β-Catenin的抑制，并取消联合处理对LC3、Beclin1和p62等自噬相关标志物的明显改变。
讨论部分总结：研究将植物化学物与化疗药联合作为提高晚期GC疗效的策略。既往已证实γ-T3单药可抑制GC细胞增殖；本研究显示γ-T3联合低剂量OXA（2.0 mg/kg b.w.）较既往高剂量OXA方案体现协同抑瘤并关注安全性。联合作用与CSCs抑制、细胞周期阻滞相关。自噬相关标志物在联合处理后向LC3-II/LC3-I升高、Beclin1升高、p62降低方向变化，CQ挽救实验支持其为自噬依赖性细胞死亡而非单纯保护。ARHGAP29在GC中高表达并与不良预后相关，CETSA支持γ-T3直接结合ARHGAP29并提高其热稳定性，Co-IP支持ARHGAP29与GSK-3β物理互作；联合处理下调ARHGAP29并抑制GSK-3β/β-Catenin信号，ARHGAP29过表达可逆转上述表型。作者指出局限包括未用溶酶体抑制剂进行自噬流检测以区分自噬体形成与溶酶体清除、仅采用ARHGAP29过表达模型而缺乏敲低验证、未进行转录组筛选下游介质；未来拟采用SPR或ITC、shRNA稳定敲低、mRFP-GFP-LC3双荧光自噬流检测及转录组筛选完善机制。
研究结论（译）：γ-T3与OXA联合是一种有前景的治疗策略，可提高GC中奥沙利铂敏感性并改变自噬相关标志物表达，至少部分通过ARHGAP29相关的GSK-3β/β-Catenin信号调节实现。
