Stemonine通过激活SIRT3缓解UVB诱导的角质形成细胞衰老

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Stemonine Alleviates UVB-Induced Keratinocyte Senescence by Activating SIRT3

　　

紫外线B（UVB）辐射是导致皮肤损伤的主要环境因素，主要通过加速细胞衰老，进而引起皮肤功能受损和提前老化。近期研究表明，Stemonine作为一种天然生物碱，因其已有的生物活性而显示出治疗潜力。在本研究中，研究人员探讨了Stemonine对永生化人角质形成细胞系HaCaT抵御UVB诱导的细胞衰老的保护作用，并阐明了其潜在机制。结果表明，Stemonine显著提高了UVB照射的HaCaT细胞的存活率，减轻了氧化应激，并改善了线粒体功能障碍。此外，Stemonine处理减少了DNA损伤信号，下调了关键衰老执行因子（如乙酰化p53和p21）的表达，并降低了SA-β-Gal活性。重要的是，Stemonine上调了SIRT3的表达和活性。至关重要的是，当SIRT3被敲低后，Stemonine的保护作用基本消失，表明其作用经由SIRT3通路介导。这些发现提示Stemonine是缓解UVB诱导的皮肤老化的有前景的候选药物。

皮肤是人体最大的器官，构成抵御外界环境因素的首要物理和免疫屏障。长期暴露于太阳紫外线（UV）尤其是中波紫外线（UVB）会直接引起DNA损伤、氧化应激和线粒体功能障碍，加速皮肤细胞衰老，导致皱纹、弹性下降和色素沉着等光老化表现。细胞衰老是不可逆的细胞周期停滞状态，衰老细胞分泌炎症因子等形成衰老相关分泌表型（SASP），进一步损害组织微环境。目前急需寻找高效、安全的天然活性成分来防治皮肤光老化。Stemonine是从中药百部中分离得到的吡咯烷酮类生物碱，已有研究表明其具有杀虫、镇咳、抗炎、抗氧化等生物活性，但其对皮肤光老化的保护作用尚未被探索。鉴于SIRT3（线粒体去乙酰化酶）是线粒体基质中的主要去乙酰化酶，在调控应激反应和衰老中发挥关键作用，研究人员假设Stemonine可能通过调节SIRT3信号来减轻UVB诱导的角质形成细胞衰老。

为验证这一假设，研究人员以永生化人角质形成细胞系HaCaT（购自武汉普诺赛，2025年3月，STR鉴定匹配率98.41%）为体外模型，利用40 mJ/cm²的UVB照射建立光老化模型。主要技术方法包括：CCK-8法检测细胞活力；DHE荧光探针检测胞内活性氧（ROS）水平；生化试剂盒检测谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、SIRT3活性、ATP水平、线粒体复合物IV活性和端粒酶活性；RH123染色评估线粒体膜电位（MMP）；碱性彗星实验定量DNA链断裂；SA-β-Gal染色检测衰老细胞比例；RT-qPCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白表达；利用慢病毒介导的short hairpin RNA（shRNA）敲低SIRT3；采用无细胞重组酶实验和分子对接评估Stemonine对SIRT3的直接激活作用。

3.1 Stemonine对HaCaT细胞活力的影响：CCK-8检测显示，Stemonine在0–800 μM浓度范围内处理48 h对HaCaT细胞无明显毒性；UVB照射呈剂量依赖性降低细胞活力，而UVB后给予Stemonine（100–800 μM）能浓度依赖性地恢复细胞活力，其中800 μM处理使存活率恢复至对照的93.6%。这表明Stemonine对UVB诱导的细胞毒性具有保护作用。

3.2 Stemonine缓解UVB诱导的氧化应激：DHE染色显示UVB使细胞内ROS水平升高至对照的3.6倍，同时GSH含量和SOD活性显著下降；Stemonine（400和800 μM）处理后，ROS分别降至对照的2.3倍和1.7倍，并显著恢复GSH和SOD水平，表明其能减轻氧化应激。

3.3 Stemonine改善UVB诱导的线粒体功能障碍：UVB照射导致MMP降低58%，ATP生成减少，线粒体呼吸链复合物IV活性下降；Stemonine（400、800 μM）显著恢复MMP至对照的68%和89%，并增强ATP产量和复合物IV活性，提示其保护线粒体功能。

3.4 Stemonine减轻UVB诱导的细胞衰老：经14天UVB慢性暴露后，细胞端粒酶活性和hTERT mRNA表达显著降低，SA-β-Gal阳性细胞比例从5.1%增至62.7%；Stemonine处理显著逆转这些变化，剂量依赖性地减少SA-β-Gal阳性细胞，显示其抗衰老作用。

3.5 Stemonine减轻DNA损伤并抑制衰老信号：碱性彗星实验表明，UVB显著增加尾距（tail moment）和尾部DNA百分比，Stemonine处理剂量依赖性地减少DNA断裂。同时，UVB上调的DNA损伤标志物γ-H2AX、乙酰化p53和p21蛋白水平均被Stemonine显著抑制，表明其通过减轻DNA损伤而下调p53/p21衰老信号通路。

3.6 Stemonine上调SIRT3表达和活性并直接结合其变构口袋：UVB显著降低SIRT3的mRNA、蛋白水平和酶活性；Stemonine处理浓度依赖性地恢复SIRT3表达和活性。无细胞实验显示Stemonine能直接激活重组人SIRT3，在100–800 μM浓度下使酶活性提高1.35–2.80倍，与已知变构激活剂honokiol效果相当。分子对接显示Stemonine通过氢键（与Phe294骨架酰胺NH形成2.95 ?氢键）和疏水相互作用嵌入SIRT3变构腔，提示其是直接的SIRT3变构激活剂。

3.7 SIRT3敲低废除Stemonine的保护作用：使用慢病毒shRNA敲低SIRT3超过70%后，Stemonine（800 μM）不能显著抑制UVB诱导的p21和乙酰化p53上调，也无法恢复hTERT表达或减少SA-β-Gal阳性细胞。这证明Stemonine的抗衰老作用依赖于SIRT3。

讨论部分指出，本研究首次证明Stemonine通过直接激活SIRT3保护角质形成细胞免受UVB诱导的衰老。与传统的被动自由基清除剂不同，Stemonine通过直接变构结合SIRT3、转录水平维持其表达以及改善线粒体生物能量学这三重机制发挥作用。然而，该研究仅基于体外细胞模型，缺乏动物和临床验证，且Stemonine的有效浓度较高，未来需借助纳米载体或结构类似物提高其经皮递送效率，并进一步在动物光老化模型和3D皮肤模型中验证其疗效。

结论部分：本研究首次实验证明Stemonine通过特异性激活SIRT3有效减轻UVB诱导的人角质形成细胞衰老。研究发现SIRT3激活协调了一系列细胞反应，包括（1）通过增强SOD活性和GSH合成显著减少氧化应激；（2）通过恢复膜电位、增加ATP产生和增强复合物IV活性改善线粒体功能；（3）减轻持续性DNA损伤。这些发现将SIRT3激活确定为Stemonine在体外减轻UVB诱导角质形成细胞衰老的中心机制，同时强调仍需进行体内临床前研究和临床评价以确定其真正的治疗潜力。