《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Chronic Intermittent Hypoxia Aggravates the Pyroptosis of Renal Tubular Epithelial Cells Through Regulating Mitophagy-Mediated NLRP3 Inflammasome Activation
编辑推荐：
阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）所致肾损伤由慢性间歇性缺氧（CIH）触发。研究人员既往研究已揭示，CIH通过激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体触发肾小管上皮细胞焦亡，但CIH激活NLRP3炎症小体的机制仍不明确。研究人员将大鼠和人肾近端小
阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）所致肾损伤由慢性间歇性缺氧（CIH）触发。研究人员既往研究已揭示，CIH通过激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体触发肾小管上皮细胞焦亡，但CIH激活NLRP3炎症小体的机制仍不明确。研究人员将大鼠和人肾近端小管上皮细胞（HK-2）暴露于CIH以建立CIH模型。通过组织病理学染色、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平检测评估肾损伤。采用蛋白质印迹和免疫荧光法检测与NLRP3炎症小体、焦亡和线粒体自噬相关蛋白。检测线粒体膜电位及活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）生成以评估线粒体功能。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、乳酸脱氢酶（LDH）释放和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估细胞损伤和炎症。应用线粒体分裂抑制剂1（Mdivi-1）进行挽救实验。CIH在体内诱导肾损伤并抑制线粒体自噬，表现为病理特征恶化、Scr和BUN水平升高、线粒体外膜转位酶20（Tom20）与微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）共定位减少，以及LC3-II/I比值、自噬相关蛋白5（Atg5）、PTEN诱导激酶1（PINK1）和Parkin表达下调。PINK1过表达通过增强线粒体与LC3B共定位、上调LC3-II/I比值和Atg5恢复线粒体自噬，并通过增强线粒体膜电位、减少ROS生成和增加ATP含量恢复CIH暴露HK-2细胞的线粒体功能。PINK1过表达改善CIH暴露HK-2细胞的细胞活力、减轻炎症和NLRP3炎症小体介导的焦亡，上述作用可被Mdivi-1部分消除。PINK1部分通过恢复线粒体自噬和线粒体功能减轻CIH暴露HK-2细胞中NLRP3炎症小体介导的焦亡，为OSA相关肾脏疾病提供潜在治疗策略。
阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是以睡眠期间上气道反复完全或部分塌陷为特征的睡眠相关呼吸障碍，CIH（慢性间歇性缺氧）是其病理生理的关键驱动因素，并可引起包括肾损伤在内的多器官损害。肾脏作为高耗氧器官对CIH所致循环性氧脱饱和—复氧尤为敏感。既往研究显示CIH可激活NLRP3（NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3）炎症小体并触发肾小管上皮细胞焦亡（pyroptosis），但CIH如何激活NLRP3炎症小体尚不清楚。线粒体功能障碍与CIH相关肾损伤密切相关，线粒体自噬（mitophagy）作为选择性自噬可清除受损线粒体；线粒体自噬缺陷可导致受损线粒体积累、ROS（活性氧）过量及线粒体危险信号释放，从而驱动NLRP3炎症小体活化。PINK1（PTEN诱导激酶1）/Parkin通路是研究较充分的线粒体自噬通路，但CIH条件下肾小管上皮细胞线粒体自噬状态及其是否为NLRP3持续活化的上游触发因素尚不明确。因此，该研究旨在探讨CIH诱导肾损伤中线粒体自噬状态，并阐明PINK1/Parkin介导线粒体自噬调控NLRP3炎症小体相关焦亡的机制。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员采用雄性Wistar大鼠（7–9周龄，Topgene Biotechnology，长沙）建立8周CIH模型，并以HK-2细胞（Procell，武汉）建立体外CIH模型。通过H&E/PAS染色及BUN/Scr评估肾损伤；采用蛋白质印迹、qRT-PCR和免疫荧光检测线粒体自噬、NLRP3炎症小体及焦亡相关分子；采用JC-1、DCFDA及ATP检测评估线粒体膜电位、ROS和ATP；采用CCK-8、LDH释放和ELISA评估细胞活力、损伤及IL-1β/IL-18分泌；通过PINK1过表达（OE-PINK1）和Mdivi-1挽救实验验证通路。
3.1 CIH在体内诱导肾损伤并抑制线粒体自噬：通过CIH大鼠模型及H&E/PAS染色发现肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性及炎性细胞浸润，Scr和BUN升高；蛋白质印迹显示p62升高，LC3-II/I比值、Atg5、PINK1和Parkin降低；免疫荧光显示Tom20与LC3B共定位减少。结论为CIH导致肾损伤并抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。
3.2 PINK1过表达恢复CIH暴露HK-2细胞的线粒体自噬和线粒体功能：通过OE-PINK1转染验证过表达后，蛋白质印迹显示Parkin、LC3-II/I和Atg5下调及p62上调被部分逆转；免疫荧光显示MitoTracker Red标记线粒体与LC3B共定位部分恢复；JC-1显示线粒体膜电位部分恢复，ROS降低、ATP增加。结论为PINK1介导的线粒体自噬对维持CIH条件下HK-2细胞线粒体稳态具有重要作用。
3.3 PINK1过表达减轻CIH暴露HK-2细胞中NLRP3炎症小体介导的焦亡：通过CCK-8和LDH释放实验显示PINK1过表达减轻CIH所致细胞活力损失和LDH释放；蛋白质印迹显示NLRP3、ASC（含CARD的凋亡相关斑点样蛋白）、cleaved caspase-1、GSDMD-N（Gasdermin-D N端成孔结构域）、IL-1β和IL-18表达降低；免疫荧光显示GSDMD-N表达减弱；ELISA显示上清IL-1β和IL-18分泌降低。结论为PINK1过表达保护HK-2细胞免于CIH诱导的焦亡。
3.4 抑制线粒体自噬消除PINK1对CIH诱导HK-2细胞焦亡的保护作用：通过Mdivi-1处理发现其单独加重CIH所致细胞活力损失和LDH释放，并消除PINK1过表达的保护作用；蛋白质印迹和免疫荧光显示Mdivi-1增强NLRP3炎症小体活化及焦亡，并削弱PINK1过表达的抑制作用；ELISA显示Mdivi-1促进IL-1β/IL-18分泌并逆转PINK1过表达的抑制作用。结论为PINK1通过介导线粒体自噬发挥保护作用，线粒体自噬受损可能是CIH诱导NLRP3炎症小体活化和焦亡的关键上游事件。
讨论部分总结：该研究讨论指出，CIH暴露导致PINK1下调、线粒体自噬不足、受损线粒体积累及ROS过量产生，进而促进NLRP3炎症小体组装并触发焦亡及IL-1β/IL-18释放；PINK1过表达通过恢复线粒体自噬和线粒体功能减轻NLRP3炎症小体介导的焦亡。讨论将该机制与既往在CIH暴露的支气管上皮细胞、心肌细胞和神经元中观察到的线粒体自噬抑制、线粒体损伤及炎症/氧化应激增强相联系，并指出增强PINK1介导的线粒体自噬可能打破“线粒体损伤—线粒体自噬不足—炎症放大”循环。局限性包括：未在CIH动物模型验证PINK1介导线粒体自噬的治疗效果；CIH抑制PINK1表达的具体机制尚不清楚，可能涉及HIF-1α（缺氧诱导因子-1α）、AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）、FoxO3a（叉头框蛋白O3a）及蛋白降解等但需进一步研究；研究主要关注PINK1/Parkin通路，BNIP3/NIX等其他线粒体自噬机制可能参与；Mdivi-1并非直接或特异性的线粒体自噬抑制剂，未来需采用siRNA（小干扰RNA）敲低PINK1或Parkin等遗传学方法验证。
研究结论翻译：综上，研究结果揭示了CIH与肾损伤之间新的机制联系：CIH通过抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，导致受损线粒体积累、ROS过量产生及随后NLRP3炎症小体活化，从而加重肾小管上皮细胞焦亡。恢复PINK1表达或增强线粒体自噬可能成为预防OSA患者肾脏疾病进展的有前景治疗策略。
