《New Biotechnology》：Enhanced violacein production by synthetically engineered mutualistic
Escherichia coli co-culture biofilms in a spatially partitioned bioreactor system.
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紫色杆菌素（VIO）是一种由多种细菌产生的紫色双吲哚类次级代谢产物，其中Chromobacterium violaceum是最突出的天然生产菌之一。VIO由L-色氨酸经VioA、VioB、VioE、VioD和VioC依次催化合成。由于VIO水溶性差且疏水，其倾
紫色杆菌素（VIO）是一种由多种细菌产生的紫色双吲哚类次级代谢产物，其中Chromobacterium violaceum是最突出的天然生产菌之一。VIO由L-色氨酸经VioA、VioB、VioE、VioD和VioC依次催化合成。由于VIO水溶性差且疏水，其倾向于在细胞内或细胞膜处积累，而非自由分泌至周围培养基中。疏水性产物积累可对重组大肠杆菌造成生理胁迫并限制其生长。在天然生产菌中，VIO的形成常与胁迫诱导的生物膜形成及群体感应（QS）调控相关。VIO及其衍生物因具有抗癌、抗病毒、免疫调节、抗菌、抗真菌、抗原虫、抗利什曼原虫及抗线虫等广泛生物活性而备受关注。此外，VIO对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株具有活性，并据报道可启动肿瘤细胞死亡及增强CHO细胞中免疫球蛋白的产生。除药理应用外，其在可见光谱下的强吸收及染色特性使VIO成为医疗保健、化妆品和纺织领域的潜在目标。VIO广泛的应用潜力激发了研究人员开发高效微生物生产平台的兴趣。由于天然生产菌（如C. violaceum）具有致病性，多项研究探索了工程化大肠杆菌作为更安全、易于管理的宿主用于粗VIO生产。以往多数研究依赖纯培养大肠杆菌，而近期研究探索了合成E. coli–E. coli共培养，以将代谢负担分配到共培养中的特化菌株。最近，Mehta等表明，合成大肠杆菌共培养中的分工策略使VIO产量较相应的单培养基准提高2.5倍。然而，此类系统中的高效VIO生产不仅取决于菌株比例，还取决于伴侣菌株之间的高效交叉喂养（cross-feeding）。在自由悬浮培养中，伴侣细胞分散，种群比例的波动可能限制局部前体可用性，进而降低生产效率。研究人员假设生物膜可通过创建具有更高局部细胞密度和更近细胞间距离的局部生态位来克服这些限制，从而改善共培养伴侣之间的代谢物交换。此外，生物膜可通过缓慢生长和QS使细胞代谢转向生产。近期研究已将大肠杆菌生物膜用于高价值产物的高效生产。此外，已有报道在天然生产菌（如C. violaceum和Janthinobacterium lividum培养物）的纯培养中实现基于生物膜的VIO生产。尽管合成大肠杆菌共培养、基于载体的生物膜培养和空间结构生物反应器此前均已各自被研究，但其联合用于VIO生产以及在同一过程中对悬浮态和生物膜相关生产率进行直接比较尚未被系统评估。这表明基于工程化大肠杆菌共培养的生物膜法粗VIO生产仍是一种尚未探索且具有潜在前景的策略。因此，本研究旨在确定载体相关生物膜形成能否为互养大肠杆菌共培养中的粗VIO形成创造更高产的生理状态。为此，研究使用了既往研究中描述的由ANT-5和TRP-5组成的共培养。这些菌株的使用基于其生长和粗VIO生产所需的相互代谢依赖性。由于大肠杆菌生长的最适温度为37 °C，而VIO生产更适宜25 °C，既往研究在双室生物反应器系统中考察该共培养，以在空间上分离生长与生产条件。此外，研究人员在摇瓶规模下使用不同碳源探索了同一共培养的一锅法（one-pot）培养策略。本研究将该一锅法培养概念扩展至生物反应器规模，以简化工艺并提高可放大性。为此，开发了一种空间分隔生物反应器装置，在好氧搅拌罐区和限氧载体区之间进行动态再循环。该系统使生物量分配为两种生理状态：含浮游组分的悬浮态和含生物膜相关组分的黏附态。随后对两种组分在生物量分布、菌株组成、粗VIO生产以及最重要的生物量归一化比粗VIO生产方面进行比较。
一、研究背景与存在的问题
紫色杆菌素（violacein，VIO）是一种由多种细菌产生的紫色双吲哚类次级代谢产物，具有抗癌、抗病毒、抗菌、免疫调节及染色等多种生物活性，在医药、化妆品和纺织等领域应用前景广泛。由于天然生产菌如Chromobacterium violaceum具有致病性，工程化大肠杆菌（Escherichia coli）被用作更安全、易管理的粗VIO生产宿主。以往研究多依赖纯培养，近期则探索合成E. coli–E. coli共培养以分配代谢负担，其中Mehta等报道分工策略使VIO产量较单培养提高2.5倍。然而，悬浮培养中伴侣细胞分散，种群比例波动会限制局部前体可用性，从而降低生产效率。研究人员假设生物膜可形成局部细胞密度更高、细胞间距更近的生态位，改善共培养伴侣间代谢物交换，并借助缓慢生长和群体感应（quorum sensing，QS）使代谢转向产物合成。尽管合成共培养、载体生物膜培养与空间结构生物反应器各自已有研究，但三者联合用于VIO生产、并在同一过程中直接比较悬浮态与生物膜态生产率，尚未被系统评估。
二、研究开展与结论
研究人员采用互养共培养ANT-5（色氨酸营养缺陷型）与TRP-5（邻氨基苯甲酸营养缺陷型、产VIO菌株），在空间分隔生物反应器中进行补料分批培养：好氧搅拌罐区维持悬浮态，限氧的Fibra-Cel?圆片（FCDs）柱区形成黏附生物膜态，两区连续再循环。研究得出，三种生物学重复中黏附态生物量归一化粗VIO产量均高于对应悬浮态，生物膜虽占总生物量比例小，却贡献了可观的VIO产量，表明生物膜相关生理状态是有前景的强化靶点。
三、关键技术方法
主要方法包括：采用ANT-5与TRP-5互养共培养，在空间分隔生物反应器（搅拌罐连接填充Fibra-Cel?圆片的柱体）中进行补料分批发酵，通过温度由37 °C切换至25 °C结合阿拉伯糖与IPTG诱导分离生长与生产阶段；以麦康凯琼脂平板计数测定菌株比例；采用玻璃珠破碎乙醇法提取胞内粗VIO并进行定量；通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）与荧光显微镜（fluorescence microscopy，FM）对生物膜进行定性与表征；对生物量归一化产量采用log10转换的双尾配对t检验进行统计。菌株来源为既往研究已描述的菌株。
四、研究结果
3.1 悬浮态的生长、菌株动态、代谢物谱与生物量比粗VIO生产率
三个重复的生长与葡萄糖消耗趋势可比，R1最终生物量最高（9.25 g L?1），R2、R3分别为7.67和6.86 g L?1。初始约50:50的ANT-5:TRP-5比例在培养后期均向ANT-5优势偏移，R1最终约64:36、R2约94:6、R3约78:22。初始补充的ANT与TRP均被消耗，后期TRP降至检测下限（约0.5 mg L?1）以下，提示TRP可能成为限制因素。粗VIO滴度R1最高（385.10 mg L?1），R3为235.57 mg L?1，R2最低（58.95 mg L?1）。悬浮态最大瞬时生物量比粗VIO生产率（qVIO）为3.93–12.78 mg (g h)?1，与既往同类系统处于同一数量级。
3.2 48 h时黏附态与悬浮态的绝对生物量及菌株比例
黏附态总生物量以R2最高（3.54 g，其中TRP-5 0.20 g、ANT-5 3.34 g），R1次之（1.82 g，TRP-5 0.65 g、ANT-5 1.17 g），R3最低（1.33 g，TRP-5 0.30 g、ANT-5 1.03 g）。悬浮态生物量以R1最高（14.95 g）。由于最终菌株比例差异，黏附态TRP-5生物量呈R1 > R3 > R2。SEM显示结构化表面相关生物量与基质样层，FM显示DAPI与ConA阳性信号，支持形成生物膜样结构而非简单细胞滞留。
3.3 黏附态与悬浮态的比粗VIO产量及总粗VIO产量
三个重复的黏附态比粗VIO产量均高于悬浮态：R1为521.52 mg g?1（为悬浮态115.52 mg g?1的4.51倍），R2为2929.30 mg g?1（为146.11 mg g?1的20.05倍），R3为803.39 mg g?1（为145.83 mg g?1的5.51倍）；log10转换双尾配对t检验显示差异显著（p = 0.0473，n = 3）。总粗VIO产量R1为963.34 mg（黏附态341.38 mg、悬浮态622.34 mg），R2为666.56 mg（黏附态575.52 mg、悬浮态91.04 mg），R3为602.59 mg（黏附态237.42 mg、悬浮态365.17 mg）。尽管黏附态生物量占比较小，却对粗VIO生产贡献显著，表明黏附生物膜态提供更有利的生产环境。
3.4 通过SEM与FM对生物膜的观察、定性与表征
SEM证实三个重复的FCD样品表面均形成生物膜，且不同样品间异质性与黏附生物量分布差异一致。FM显示全部重复均存在DAPI阳性（细胞）与ConA阳性（胞外多糖基质）信号，确认黏附态同时含细胞与胞外基质组分，支持其为结构良好的生物膜而非松散附着细胞。
3.5 观察到的重复间变异
尽管均以约1:1起始，最终菌株组成差异明显，伴随不同粗VIO滴度与FCD相关生物量，使黏附态生物量归一化粗VIO产量的提升幅度在4.51倍（R1）至20.05倍（R2）之间变化，表明该系统存在显著的生物学异质性与重复间不稳定性；但效应方向在所有重复中保持一致。
五、讨论与结论
讨论部分指出：动态生物量分配造成重复间差异，但黏附态比产量更高这一趋势一致，本研究主要贡献在于证明互养重组E. coli共培养的黏附生物膜态在同一培养系统中可表现出显著更高的生物量归一化粗VIO产量。载体滞留与限氧共同塑造黏附态生理；生物膜内ANT-5与TRP-5空间邻近可减少ANT在主体液相中的稀释（估计悬浮态ANT释放被稀释约56–62倍），提高TRP-5对ANT的摄取，与最高黏附ANT-5贡献的R2比产量最高、最低的R1最低相吻合；限氧下缓慢生长或类静息细胞减少TRP流向生物量、使更多通量进入VIO途径，且更耐受产物积累。37 °C生长与25 °C生产的温度切换进一步支持生长与生产阶段的分离。方法学局限包括黏附态仅能终点破坏性取样、干固体估算偏保守可能低估真实细胞比生产、显微样品经冻融处理及无法解析生物膜形成时间进程等。结论部分译文：本研究揭示，合成大肠杆菌共培养生物膜较对应悬浮细胞具有更高的比粗VIO产量，因而识别出生物膜相关生理状态（而非仅载体滞留）是强化合成共培养系统粗VIO生产的有前景靶点。黏附态产量的提升可能与局部代谢物交换改善、生长缓慢及生物膜内限氧环境有关。尽管黏附态仅占总生物量较小比例，其在同一过程中对总粗VIO生产贡献显著。空间分隔生物反应器装置在单一培养系统中促成了两种不同生理状态——悬浮浮游组分与黏附生物膜相关组分——的形成，从而可对两种状态的生物量分布、菌株组成及生物量归一化粗VIO产量进行直接比较。结合闭环VIO提取，所提出的方法为利用模块化共培养生物膜强化胞内次级代谢产物生产提供了简单且可放大的概念验证。工艺条件、载体选择与生物膜控制的进一步优化可支持其应用于更大规模的基于生物膜的高价值产物生物过程。
