长春花（Catharanthus roseus）叶提取物介导的壳聚糖基ZnO/Ag纳米复合材料ZCAL的制备、表征及其对MDA-MB-231和A-549癌细胞的体外抗癌活性

《Next Materials》：Naturally derived chitosan-based ZnO/Ag nanocomposite mediated by Catharanthus roseus leaf extract for anticancer applications

以长春花（Catharanthus roseus）叶提取物为介导，通过共沉淀法成功合成壳聚糖（CS）基ZnO/Ag纳米复合材料（NC）。该纳米复合材料对MDA-MB-231和A-549癌细胞表现出细胞毒性，半数最大抑制浓度（IC₅₀）分别为33.7 ± 3.0和19.6 ± 1.0 μg/mL。ZCAL（ZnO/CS:Ag:C. roseus纳米复合材料）增强凋亡诱导，突显其抗癌应用潜力。

研究背景与意义：纳米技术为生物医学多功能材料开发提供了途径。金属氧化物纳米颗粒（nanoparticles, NPs）中，ZnO NPs因理化特性和生物相容性而用于药物载体、抗菌、抗糖尿病及抗癌；为增强效果，研究人员将其与生物可降解壳聚糖（chitosan, CS）复合，CS的氨基可结合金属离子并稳定纳米复合材料（nanocomposite, NC）。Ag NPs在伤口愈合、生物传感、催化及癌症治疗等方面具应用价值，植物介导合成具有简单、低成本、环境友好等特点。Catharanthus roseus富含生物碱、黄酮和酚类，尤其vinblastine、vincristine和catharanthine具重要药用和抗癌价值。既有研究分别涉及壳聚糖/ZnO、壳聚糖/Ag及C. roseus介导Ag NPs，但将其整合为C. roseus提取物介导的Ag功能化ZnO/CS纳米复合材料（ZCAL）并系统评价癌细胞的研究有限，故开展本研究。N. Ambika Devi、M. Meenakshi Sundari、Elumalai Perumal、Palanisamy Murugan、C. Ashwin和R. Mohan等制备ZCAL，表征其结构、化学和形貌，评估其对MDA-MB-231和A-549的细胞毒、形态变化和凋亡诱导，并用3T3-L1成纤维细胞评估细胞相容性。研究结论为ZCAL呈剂量依赖细胞毒并增强凋亡诱导，晶粒尺寸约24 nm，意义在于为ZCAL的生物医学应用提供结构特征和体外生物效应基础。

关键技术方法：以C. roseus叶提取物介导，采用共沉淀法制备ZCAL；壳聚糖由蟹壳经脱矿、脱蛋白、脱乙酰提取（蟹壳采自印度Tamilnadu Devakottai附近鱼市场；C. roseus鲜叶采自Sivagangai District学院校园；MDA-MB-231和A-549购自印度Pune国家细胞科学中心NCCS）。采用X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）、场发射扫描电子显微镜（field emission scanning electron microscopy, FESEM）、能量色散X射线谱（energy dispersive spectroscopy, EDS/EDAX）及元素映射表征；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测细胞活力；相衬显微镜观察形态；溴化乙锭（ethidium bromide, EtBr）荧光成像检测凋亡；数据以mean ± SEM表示，采用one-way ANOVA及Tukey事后检验，p<0.05，GraphPad PRISM 10.4.2绘图。

研究结果：3.1 结构分析（Structural analysis）：XRD显示ZCAL在31.6°、34.3°、36.1°、47.4°、56.5°、62.7°、67.8°、69.02°、72.5°和76.9°出现对应（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（112）、（201）、（004）和（202）晶面的峰，主峰表明六方纤锌矿ZnO结构，与JCPDS card no. 36–1451一致；2θ=38.3°和44.5°的小峰分别对应（111）和（200），确认金属Ag（JCPDS file no: 04–0783）；2θ=19.5°对应壳聚糖。Scherrer公式计算晶粒尺寸为24 nm，说明ZnO、CS和C. roseus介导Ag NPs间相互作用增强理化及细胞毒性能。3.2 FTIR分析（FTIR analysis）：3200–3500 cm^?1为O-H和N-H伸缩振动；2931和2890 cm^?1为C-H不对称和对称振动；1623 cm^?1为C=O（酰胺-I）；1570 cm^?1为N-H弯曲（酰胺-II）；1383 cm^?1为COO^?；1326 cm^?1为硝基化合物N-O对称伸缩；1118 cm^?1为脂肪胺C-N伸缩；1074 cm^?1为C-O-C伸缩；低于580 cm^?1为Zn-O伸缩，验证ZnO存在。多峰表明ZnO、CS和Ag NPs间存在分子间相互作用，ZCAL通过氢键、静电作用和配位稳定，植物化学物起还原和封端作用。3.3 FESEM、EDAX与元素映射分析（FESEM, EDAX with elemental mapping analyses）：FESEM显示ZCAL呈米粒状结构及片状粗糙表面，ZnO嵌入壳聚糖聚合物基质；EDAX确认Zn、C、O、N和Ag存在，元素映射显示Ag均匀掺入ZnO/CS NC；粒径分布平均约450 nm。3.4 细胞毒活性（Cytotoxic activity）：MTT显示ZCAL以剂量依赖方式降低MDA-MB-231和A-549细胞活力，24 h处理后半数最大抑制浓度（IC₅₀）按正文为MDA-MB-231 19.6 ± 1.0、A-549 33.7 ± 3.0 μg/mL；细胞毒主要与纳米复合材料细胞内化有关，壳聚糖和锌联合促进其与带负电癌细胞相互作用，进入细胞膜、损伤DNA并抑制生长；Zn²⁺和Ag可致氧化应激、增加活性氧（reactive oxygen species, ROS）并诱导细胞毒，壳聚糖与提取物生物活性植物化学物协同增强抗癌效率。需注意，原文摘要亮点以“respectively”给出MDA-MB-231 33.7 ± 3.0、A-549 19.6 ± 1.0 μg/mL，而正文3.4、3.5、3.6、3.7及结论采用MDA-MB-231 19.6 ± 1.0、A-549 33.7 ± 3.0 μg/mL，表1亦标注MDA-MB-231 19.6、A-549 33.7；以上按正文和结论浓缩。3.5 细胞形态（Cell morphology）：相衬显微镜观察MDA-MB-231（10和19.6 μg/mL）和A-549（10和33.7 μg/mL）处理24 h，细胞出现皱缩和质膜泡状突起，呈剂量依赖形态改变，提示凋亡性细胞死亡；与Revathi等报道CS-CuO-NS对MCF-7通过凋亡相关机制产生细胞毒的结果一致。3.6 凋亡荧光成像（Apoptosis fluorescence imaging）：EtBr染色后荧光显微镜显示处理组细胞呈橙色和红色荧光，EtBr进入质膜完整性受损细胞并结合核酸产生荧光，提供ZCAL诱导MDA-MB-231和A-549细胞死亡的定性证据。3.7 体外细胞活力分析（In vitro cell viability analysis）：3T3-L1成纤维细胞经2.5–40 μg/mL ZCAL处理24 h，至20 μg/mL时细胞活力与未处理对照无显著差异，≥30 μg/mL时活力略降，呈剂量依赖；相衬显微镜未见细胞毒性相关形态变化，细胞保持正常纺锤形。基于IC₅₀ 19.6 ± 1.0和33.7 ± 3.0 μg/mL，MDA-MB-231和A-549的选择性指数分别为1.02和0.60，反映与3T3-L1成纤维细胞相比未获得优先细胞毒性。

讨论与结论：结果与讨论合并表明，XRD、FTIR、FESEM、EDAX及元素映射确认ZCAL形成、组分相互作用及Ag均匀掺入；细胞毒、形态和EtBr荧光成像提示ZCAL对MDA-MB-231和A-549具剂量依赖细胞毒并诱导凋亡，其增强作用与ZnO、CS、C. roseus介导Ag颗粒及植物化学物协同、ROS和DNA损伤相关；3T3-L1细胞相容性及选择指数提示无优先细胞毒性。研究结论翻译：ZCAL纳米复合材料通过共沉淀技术合成，加入C. roseus:Ag NPs进一步改善纳米复合材料性能。结构和形貌表征确认纳米复合材料形成，晶粒尺寸约24 nm。MDA-MB-231乳腺癌细胞和A-549肺癌细胞处理24 h后的IC₅₀分别为19.6 ± 1.0和33.7 ± 3.0 μg/mL。此外，形态分析和荧光成像确认凋亡诱导。采用EtBr染色和荧光显微镜检查凋亡诱导的细胞死亡。进一步通过MTT法和相衬显微镜用3T3-L1成纤维细胞评估细胞相容性。研究结果表明，ZnO、CS和C. roseus介导Ag颗粒的联合特性进一步增强抗癌行为。总体而言，本研究呈现ZCAL纳米复合材料的结构特征和体外生物效应，为其生物医学应用特性的进一步研究提供基础。