《Molecular Plant Pathology》：Assessing Zymoseptoria tritici Candidate Effectors in the Non-Host Nicotiana benthamiana Reveals Immune Recognition and Potential Host-Independent Activities
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Zymoseptoria tritici是引起小麦壳针孢叶枯病（Septoria tritici blotch, STB）的重要小麦病原菌。尽管其具有经济影响，但对Z. tritici与其宿主之间分子互作的理解仍然有限，尤其是许多未表征候选效应子的功能。在此，
Zymoseptoria tritici是引起小麦壳针孢叶枯病（Septoria tritici blotch, STB）的重要小麦病原菌。尽管其具有经济影响，但对Z. tritici与其宿主之间分子互作的理解仍然有限，尤其是许多未表征候选效应子的功能。在此，研究人员通过在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）这一异源非宿主系统中瞬时表达，评估了在早期活体营养阶段和向死体营养转变阶段表达升高的7个Z. tritici候选效应子，并比较了是否携带其预测信号肽。AlphaFold结构预测显示，其中两个候选效应子与已知功能蛋白具有相似性：一个来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甾醇结合蛋白，以及一个来自苹果腐烂病菌（Valsa mali）的坏死诱导效应子。效应子相关表型并非总是与表达时程相关，且信号肽的存在显著影响所观察到的活性。由于N. benthamiana并非Z. tritici的天然宿主，观察到的响应可能反映效应子的保守、宿主非依赖性活性或N. benthamiana的免疫识别，而非其在小麦中的天然功能。与此区分一致的是，两个候选效应子Mycgr3107904和Mycgr394290在N. benthamiana中诱导细胞死亡，同时调节活性氧（reactive oxygen species, ROS）爆发，可能表明免疫识别。一些候选效应子减弱ROS产生，提示可能靶向保守的细胞过程，而没有一个抑制PBR1介导的细胞死亡。总体而言，研究人员的结果表明，候选效应子的活性不能仅从表达谱推断，非宿主N. benthamiana系统中的响应反映了免疫识别和潜在保守活性的组合，主要用于在天然小麦–Z. tritici互作中优先选择候选效应子进行验证。
小麦病原真菌Zymoseptoria tritici引起的壳针孢叶枯病（Septoria tritici blotch, STB）是影响小麦生产的重要病害之一。尽管该病害经济影响重大，但Z. tritici与宿主间的分子互作机制仍所知甚少，特别是许多未被表征的候选效应子（effector）的功能。效应子通常为小分泌蛋白，通过调节宿主免疫促进侵染。已有研究利用异源非宿主植物本氏烟草（Nicotiana benthamiana）筛选效应子，但观察到响应可能不等同于其天然宿主功能。为了解析候选效应子的潜在功能，研究人员从感染感病小麦的RNA-seq数据中选取了7个在早期活体营养阶段及向死体营养转变阶段高表达的候选效应子，在N. benthamiana中瞬时表达，并比较有无信号肽对活性的影响；同时结合AlphaFold结构预测寻找功能线索。研究发现，部分候选效应子的活性与表达时程不一致，信号肽的存在显著影响ROS调节能力；Mycgr3107904和Mycgr394290可诱导细胞死亡，而无效应子抑制PBR1介导的细胞死亡。这些结果提示，非宿主系统中的响应包含免疫识别和保守活性，可用于优先选择候选效应子进行小麦上的验证。
主要技术方法包括：从已发表数据集（Gomez-Gutierrez et al. 2025，感病小麦品种）筛选差异表达候选效应子，经SignalP等预测信号肽后选7个；利用tBLASTx/BLASTp在18个Z. tritici分离株和3个姐妹种中分析保守性；采用AlphaFold v3.0预测结构，并与FoldSeek和DALI数据库比对；通过农杆菌介导在N. benthamiana中瞬时表达，进行几丁质诱导的ROS测定、坏死诱导试验及PBR1(D496V)细胞死亡抑制试验。
2.1 候选效应子的保守性：通过序列比对，发现大多数候选效应子在Z. tritici分离株中高度保守（>90%），而在姐妹种中一致性较低（约75%），且有些效应子在特定分离株中缺失或发生基因破坏，如Mycgr394290仅在欧洲分离株3D7、1A5和1E4中编码约60个氨基酸的截短蛋白。
2.2 AlphaFold结构预测：结构比对显示，Mycgr3111221和Mycgr3105487与F. fulva的LysM效应子Ecp6结构相似；Mycgr3109710与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甾醇结合蛋白PRY1相似；Mycgr3107904与苹果腐烂病菌（Valsa mali）坏死诱导因子VmHEP1（Hce2域）相似。这些相似性为功能推测提供了依据。
2.3 信号肽影响几丁质诱导的ROS调节：在N. benthamiana中，无信号肽时Mycgr394290和Mycgr3107904显著抑制ROS；有信号肽时，Mycgr3109710、Mycgr3103393和Mycgr3107904显著抑制ROS，而Mycgr394290则反而增加ROS（但未达显著）。这表明信号肽对于效应子功能至关重要。
2.4 无效应子抑制PBR1诱导的细胞死亡：利用DEX诱导的PBR1(D496V)自激活系统，与各效应子共表达，1天后观察细胞死亡，结果所有测试效应子均不能抑制PBR1介导的细胞死亡，说明它们不作用于该NLR或其下游信号。
2.5 两个候选效应子诱导细胞死亡：在N. benthamiana叶片中，Mycgr3107904和Mycgr394290在6天（dpi）后诱导明显细胞死亡，而对照无此现象。Mycgr3107904含Hce2域，与坏死诱导功能一致；Mycgr394290的ROS增加趋势支持其促进细胞死亡的可能。
讨论部分指出，结构预测中多数效应子N端和C端为低置信度区域，可能为内在无序区。信号肽影响功能这一结果得到验证。由于N. benthamiana并非Z. tritici天然宿主，观察到的ROS抑制和细胞死亡可能是保守的宿主非依赖活性，也可能被N. benthamiana免疫受体识别。研究存在局限性，如未分离质外体验证分泌，且非宿主受体库与小麦不同。未来需在天然宿主（小麦）中验证这些效应子的功能。
结论：候选效应子的活性不能仅从表达谱推断；非宿主N. benthamiana系统观察到的响应是免疫识别与潜在保守活性的组合，其意义在于优先筛选需要在小麦–Z. tritici互作中进一步验证的候选效应子。
