T2R14拮抗剂LW129抑制VEGF诱导的肺内皮新生血管化过程的体外研究

《Physiological Reports》：The novel role of T2R14 antagonism, by LW129, on VEGF-induced lung endothelial neovascularisation processes in vitro

　　

异常血管新生驱动的肺血管重塑是多种心肺疾病的标志，然而调控内皮细胞反应的分子通路仍不完全清楚。苦味受体（T2Rs）传统上被认为是化学感应受体，近来已被证实是血管功能的重要调节因子。然而，T2Rs在肺血管新生中的作用尚未被探索。本研究探讨了T2R14在血管内皮生长因子（VEGF）介导的人肺微血管内皮细胞（HPMECs）血管新生反应中的作用。研究人员利用选择性T2R14拮抗剂LW129，检测了T2R14抑制对关键的体外内皮血管新生过程的影响，包括VEGF诱导的增殖、迁移和毛细管样管形成。药理学拮抗T2R14显著减弱了VEGF驱动的内皮增殖、迁移和形态发生反应，揭示了T2R14信号在肺微血管新生中的新贡献。蛋白质组谱分析鉴定出一系列受LW129和VEGF暴露调控的血管新生过程分子调节因子，提示CXCL16、Endoglin、FGF-7和VEGF-C可能发挥潜在作用。这些发现将T2R14确定为VEGF依赖性内皮激活的新型调节因子，并表明靶向T2R14信号可能成为限制与异常血管新生相关的病理性肺血管重塑的治疗策略。

一、研究背景与研究目的

肺血管重塑是肺动脉高压、慢性阻塞性肺疾病及间质性肺病等多种心肺疾病的共同病理特征，其核心驱动因素之一是异常的血管新生过程。血管内皮生长因子A（VEGF-A）通过与血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）结合，启动下游PI3K/Akt、PLCγ、ERK及FAK等信号通路，促进内皮细胞的增殖、迁移、存活及毛细管网状结构形成，因此被视为生理性与病理性新生血管化的核心调控枢纽。然而，VEGF信号的过度或异常激活可导致肺泡-毛细血管屏障破坏及血管重塑加重，因此寻找能够精细调控VEGF反应的内源性调节因子具有重要治疗意义。

苦味受体（T2Rs）是一类G蛋白偶联受体，最初在味觉组织中鉴定，近年来被发现广泛表达于呼吸系统、免疫细胞、平滑肌及血管内皮等肺外器官。其中，T2R14是人体约25种T2R亚型中配体识别范围最广的受体之一，在呼吸道及肺内皮细胞中均有较高表达。已有研究表明T2R14激活可加剧脂多糖（LPS）诱导的肺微血管内皮屏障功能障碍，但其在血管新生信号中的作用尚完全未知。基于此，本研究旨在探索T2R14在VEGF诱导的肺微血管内皮细胞血管新生反应中的角色，并通过选择性拮抗剂LW129验证其作为治疗靶点的潜力。

二、研究方法概述

本研究采用人肺微血管内皮细胞（HPMECs）作为实验模型，来自男性供体的商业化原代细胞。主要技术方法包括：MTT法检测细胞活力与增殖；划痕愈合实验评估细胞迁移；Matrigel?管形成实验评价血管新生潜能；Proteome Profiler?人血管新生抗体芯片筛选差异表达的血管新生相关蛋白；ELISA定量检测VEGF释放水平。所有数据均基于至少3次独立生物学重复，采用非配对双尾Student's t检验或单因素方差分析进行统计处理。

三、研究结果

2.1 T2R14激动剂和拮抗剂在肺微血管内皮细胞中的毒性效应

研究人员首先通过MTT法检测了多种T2R14激动剂及拮抗剂LW129对HPMECs活力的影响。结果显示，各激动剂在浓度低于10 μM时对细胞活力无显著影响，而拮抗剂LW129在1 nM至10 μM范围内反而显著提高细胞活力，仅在100 μM时出现毒性下降。这表明LW129在远低于其IC₅₀的浓度下即可增强内皮细胞活性。

2.2 T2R14拮抗剂LW129影响基础状态下的内皮细胞增殖与迁移

在500 nM浓度下，LW129单独处理24小时后，HPMECs的增殖率从对照组的100%显著上升至144.88%，迁移率从100%升至123.73%。然而，细胞粘附、管形成能力及基础VEGF释放水平均未受到显著影响。这说明LW129在静息状态下选择性地促进内皮细胞的增殖和迁移，而非全面激活血管新生程序。

2.3 T2R14拮抗剂LW129抑制VEGF诱导的肺内皮血管新生过程

当加入VEGF（100 ng/mL）刺激后，LW129共处理显著逆转了VEGF诱导的细胞增殖、粘附、迁移及管形成能力增强。具体而言，VEGF单独处理所引发的促血管新生效应在LW129存在下均被明显削弱。这一结果表明T2R14信号在VEGF驱动的血管新生过程中发挥正向调控作用，阻断该受体可有效抑制病理性新生血管化。

2.4 LW129调控肺内皮细胞中关键血管新生蛋白的表达

通过Proteome Profiler?人血管新生抗体芯片分析，研究人员发现LW129单独处理仅显著上调CXCL16和PDGF-AB/PDGF-BB两种蛋白的表达。而在VEGF存在的情况下，LW129共处理使CXCL16、Endoglin、FGF-7和VEGF-C的表达较VEGF单独处理组显著下调。值得注意的是，VEGF-C是唯一在VEGF处理后显著上调、又在加入LW129后被显著回补的蛋白。这提示LW129可能通过干扰CXCL16-ERK、VEGF-C/VEGFR-3及Endoglin/VEGFR2等多条协同信号轴来阻断VEGF驱动的血管新生级联反应。

四、讨论与结论

本研究的核心发现是首次将苦味受体T2R14与肺微血管内皮细胞的血管新生调控联系起来。通过使用选择性拮抗剂LW129，研究人员证明T2R14信号在VEGF诱导的增殖、迁移、粘附和管形成等多个关键环节中均发挥促进作用。值得注意的是，LW129在基础状态下轻微增强增殖和迁移，却在VEGF刺激下显著抑制血管新生，这种上下文依赖性的调控模式提示T2R14并非简单的血管新生促进因子，而是根据微环境信号差异性地调节内皮细胞行为。

在分子机制层面，蛋白芯片结果显示LW129与VEGF共处理可下调CXCL16、Endoglin、FGF-7和VEGF-C的表达。其中，VEGF-C是唯一同时受VEGF诱导上调又被LW129逆转的因子，提示其可能是T2R14调控VEGF信号的关键下游节点。鉴于CXCL16可通过ERK/p38/AKT-HIF-1α通路刺激内皮迁移与VEGF产生，FGF-7可促进MAPK激活与趋化，Endoglin则通过与VEGFR2相互作用维持受体表面表达，这些分子的联合下调可能构成了LW129抗血管新生效应的多靶点机制。

研究结论：T2R14是VEGF依赖性内皮激活的新型调节因子，药理学阻断T2R14信号可有效抑制VEGF驱动的肺微血管内皮细胞血管新生过程。靶向T2R14可能成为限制与异常血管新生相关的病理性肺血管重塑的治疗策略。