玉米耐冷性分子基础的整合调控网络解析

《The Plant Journal》：Deciphering the molecular basis of maize cold tolerance via integrative regulatory network analysis

　　

玉米（Zea mays L.）是一种全球至关重要但对低温敏感的作物。解析冷响应、生物钟相关及激素相关转录程序的时间组织，对于阐明植物如何在冷胁迫下平衡生长与生存以保障粮食安全至关重要。研究人员对覆盖14个时间点（0–36 h冷胁迫及24 h恢复期）的108个玉米幼苗样本进行了高分辨率时间序列RNA测序（RNA-seq）。利用冠菌素（Coronatine, COR）作为明确的茉莉酸（JA）相关化学扰动，探究冷胁迫期间激素相关的转录响应。研究人员鉴定出12 986个冷响应基因和2 259个恢复响应基因，揭示了一种以光合作用相关过程受抑制和脂质分解代谢相关基因富集为特征的恢复相关转录转变，并伴随恢复早期短暂的生理胁迫。冷胁迫诱导生物钟相关转录本发生广泛的相位移动（phase shift）并降低振荡幅度，而COR处理则鉴定出不同的激素相关转录模块及候选网络关联基因，包括ZmWRKY71和ZmHSP28，其功能进一步得到分子和遗传学分析的支持。本研究建立了玉米冷胁迫及恢复的时间解析转录框架，整合了转录动态、生理响应及经实验验证的调控节点。

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一、研究背景与科学问题

玉米（Zea mays L.）作为全球最重要的作物之一，在保障粮食安全和提供工业原料方面发挥着关键作用。然而，作为起源于热带地区的C₄植物，玉米对低温极为敏感。随着全球气候变化加剧和极端天气事件频发，冷胁迫已成为制约玉米生产的主要非生物胁迫因素。特别是在中国东北等玉米主产区，晚春冷害频繁导致土壤温度低于发芽最适阈值，可延迟出苗10至15天，并引发严重叶片失绿和根系生长抑制，在严重冷害年份可造成20%至30%的产量损失。因此，解析玉米冷胁迫响应的分子机制，为培育耐冷品种提供理论依据和遗传靶点，已成为迫切的科学任务。

在分子层面，植物已进化出复杂多层次的信号网络来感知和适应冷胁迫。冷感知始于膜流动性改变，尤其是膜固化，进而激活膜定位传感器如COLD1，诱导特征性的胞质Ca²⁺内流。Ca²⁺信号随后由钙依赖蛋白激酶（CDPK）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联解码，磷酸化并激活关键上游调控因子ICE1，从而诱导CBF/DREB1家族的爆发性表达。作为主转录因子，CBF激活含有CRT/DRE顺式元件的下游冷调控基因以合成冷冻保护蛋白和渗透调节物质。重要的是，这一经典线性通路并非孤立运作，而是受生物钟调控。核心振荡器组分如CCA1和LHY通过直接结合CBF启动子或与信号蛋白物理互作来监测这些响应。此外，植物激素作为关键内源信使协调胁迫防御与生长之间的平衡。茉莉酸（JA）信号与冷响应密切相关，冷胁迫触发JA积累和COI1介导的JAZ阻遏蛋白降解，释放MYC转录因子并解除对ICE1的抑制，从而通过CBF依赖途径强力激活下游防御基因。乙烯（ET）信号通路则通过其主转录因子EIN3直接抑制CBF转录，形成防止过度防御损害生长的负反馈回路。脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）信号也与这些通路交织互作。

然而，以往研究大多聚焦于单个时钟组分或有限的胁迫时间点，玉米冷胁迫期间生物钟相关转录的时间重组以及恢复期的变化仍未得到充分解析；同时，激素相关转录响应在玉米冷胁迫中的时间组织，特别是在明确通路扰动下的表现，也尚未完全阐明。为剖析如此复杂的调控网络，化学扰动提供了常规遗传方法难以实现的时间分辨率。冠菌素（COR）作为细菌产生的聚酮类毒素，是生物活性茉莉酸-L-异亮氨酸（JA-Ile）偶联物的结构和功能模拟物，通过同一COI1-JAZ受体模块被感知，可作为明确的JA相关化学扰动来探测激素相关转录响应。

二、研究内容与主要技术方法

本研究通过整合COR介导的扰动与高分辨率转录组分析，系统研究了玉米冷胁迫及后续恢复期间转录响应的时间组织。研究人员建立了涵盖四种处理方案（正常对照N、冷胁迫C、COR预处理对照NC、COR预处理冷胁迫CC）的综合实验系统，在0–36 h冷胁迫和24 h恢复期共14个时间点采集108个样本进行深度转录组测序。主要关键技术方法包括：高分辨率时间序列RNA-seq（基于B73参考基因组RefGen_V4进行读段比对和FPKM定量）、层次聚类与主成分分析（PCA）、K-means聚类与Mfuzz软聚类分析、Gene Ontology（GO）富集分析、上下文似然关联（CLR）算法构建转录因子-基因关联网络、JTK_CYCLE算法鉴定生物钟节律基因、凝胶迁移率变动实验（EMSA）、双荧光素酶报告基因检测，以及通过农杆菌介导转化在ND101背景下创制ZmWRKY71和ZmHSP28过表达转基因系进行功能验证。

三、研究结果

冷胁迫诱导玉米幼苗分阶段转录响应

通过剂量-响应实验确定0.5 μM COR为最适浓度，因其能最有效减轻冷诱导叶片损伤和离子渗漏。表型观察显示，C组可见冷损伤始于9 h，而COR预处理的CC组损伤出现延迟至约18 h。共产生50.2亿高质量读段，平均96.59%比对到B73参考基因组，两个生物学重复间平均R²=0.95。层次聚类和PCA分析均显示冷胁迫样本与正常条件样本明显分离，且冷处理组内样本按时间顺序排列，反映冷胁迫下转录重编程的渐进推进。已知冷响应基因ZmDREB1.3和ZmMPK1在冷胁迫下显著上调，而ZmPRX108和ZmTIP4;3显著下调，验证了数据可靠性。通过C9与N9、CC18与NC18的比较发现，两个损伤相关阶段共享2135个差异表达基因（DEGs），但各自拥有大量特有DEGs，表明CC18并非C9的简单时间延迟复制，COR预处理不仅延迟可见冷损伤，还与长期冷暴露下的独特转录状态相关。基于CLR算法构建的时间解析TF-基因关联网络包含6760个基因和13 011条预测关联边，网络拓扑分析显示功能模块随时间动态转变，从早期激素信号和细胞壁组织相关过程，经DNA甲基化、细胞周期和离子跨膜转运，最终转向防御响应和营养水平响应。

冷胁迫后恢复响应基因的鉴定与功能表征

研究人员鉴定了2259个恢复响应基因（RRGs），代表从冷胁迫转向正常生长的独特转录事件。通过Mfuzz软聚类分为四个簇：R1和R2为分别在恢复6 h和12 h最大下调的基因簇，R3和R4为相应时间点峰值上调的基因簇。GO富集分析显示，下调簇R1显著富集于光系统II组装和淀粉生物合成过程，包括PSII稳定性因子ZmHCF244和磷酸甘油酸变位酶基因ZmGPM35的特异性下调，表明恢复早期伴随光合作用和初级碳水化合物代谢相关基因表达降低。上调簇R4显著富集于乙醛酸循环体和脂肪酸β-氧化通路，核心酶组分ZmCTS4（柠檬酸合酶4）和ZmECH1（烯酰辅酶A水合酶1）显著上调。生理检测进一步证实，恢复6 h时SPAD值短暂下降、离子渗漏显著增加、H₂O₂积累达峰值、MDA保持升高，表明恢复早期存在短暂的胁迫状态而非立即恢复正常生长条件。

生物钟相关基因的系统鉴定及冷胁迫下的时间重塑

基于正常对照（N）组0–24 h时间序列转录组，采用JTK_CYCLE算法鉴定出2498个具有稳健24 h振荡的生物钟基因。冷胁迫起始后，生物钟基因的相位出现约3–12 h的全局延迟，原本6 h达峰的基因移至12 h，9 h达峰的基因延迟至12 h。同时观察到振荡幅度显著衰减，昼夜表达对比度降低，最显著的阻尼发生在冷处理12 h。2498个生物钟基因中有1518个（60.8%）与冷响应基因重叠，其中包括核心生物钟组分ZmGI1和ZmGI2（GIGANTEA），表明冷胁迫影响基因表达的特定时间层。

核心冷响应基因呈现协调的激素相关与生长相关转录模式

通过COR响应基因（COR-RGs）与冷响应基因（CRGs）的交集分析，鉴定出3013个核心冷响应基因（core CRGs），分为四个簇：Cluster I为冷诱导且COR进一步增强的基因；Cluster II为冷诱导但COR抑制的基因；Cluster III为冷抑制但COR恢复或上调的基因；Cluster IV为冷和COR均抑制的基因。GO和通路分析显示，Cluster I和III均显著富集于茉莉酸响应和次生代谢过程。在JA通路中呈现明确功能分工：JA生物合成基因（ZmLOX5、ZmLOX10、ZmLOX11）属于Cluster III，而信号组分（ZmbHLH57、ZmbHLH116、ZmZIM27、ZmZIM30）属于Cluster I。ABA和SA通路呈现平行调控架构，Cluster I中COR显著增强冷诱导的关键信号转导因子表达，包括ZmCDPK19、ZmCDPK32、ZmMPK7及多个WRKY转录因子；Cluster III中COR缓解了ABA/SA生物合成和稳态相关基因的冷诱导抑制。Cluster IV富集于DNA复制调控和细胞周期过程，包括ZmCYC1、ZmCYC3、ZmCYC4等细胞周期调控因子的广泛下调。

激素相关网络鉴定参与玉米冷响应的候选转录因子

研究人员从Cluster I和III富集的四种激素信号通路（JA、ET、ABA、SA）中各选取至多三个高连接度候选转录因子，构建了包含22个候选转录因子和327个预测靶基因、共357条预测关联的激素相关TF-基因网络。网络中度最高的转录因子为ZmWRKY71（40个靶基因）、ZmEREB113（39个）和ZmbHLH116（31个）。DAP-seq数据交叉验证支持ZmEREB2与ZmDEK36、ZmPDC2启动子以及ZmWRKY27与ZmHSP6、ZmNAC70启动子的物理结合。EMSA实验证实ZmWRKY71直接结合ZmHSF24和ZmARF16启动子、ZmEREB113结合ZmBBX26和ZmbZIP91启动子、ZmbHLH116结合ZmHSP28和ZmGA2ox3启动子，且突变预测顺式元件可消除或显著减弱结合信号。双荧光素酶报告实验进一步证实三者显著抑制相应靶启动子活性。转基因功能验证表明，ZmWRKY71和ZmHSP28过表达显著增强玉米幼苗耐冷性，冷处理5天后过表达株系的叶片损伤面积和离子渗漏率均显著低于野生型ND101。

四、讨论与结论

本研究建立了玉米冷胁迫和恢复的时间解析转录框架。冷胁迫诱导的冷响应转录网络与激素相关表达程序的整合，与涉及细胞保护、激素相关转录变化和代谢调整的分阶段响应模型一致。恢复期光合作用和初级碳代谢相关转录的持续抑制，伴随脂质分解代谢基因的富集，反映了从冷胁迫向正常生长条件转变过程中的短暂代谢调整。冷胁迫诱导生物钟相关转录本发生广泛相位移动和幅度衰减，表明冷胁迫引发玉米幼苗生物钟相关表达模式的广泛时间重塑。COR相关转录变化在既定JA感知框架内被解读，COR作为探测JA相关转录响应的化学扰动工具，其结果提示激素相关转录重塑而非确认的通路激活。网络关联基因ZmWRKY71和ZmHSP28经实验验证为玉米耐冷性的贡献因子，代表经实验支持的候选组分和改良玉米耐冷性的潜在遗传资源。

综上所述，本研究通过整合冷诱导的生物钟相关转录变化、COR相关的激素相关表达程序和代谢重构，建立了玉米冷胁迫响应的时间解析框架，为理解玉米冷响应的动态组织提供了见解，并为遗传改良提供了潜在靶点。