核输入蛋白α1 AtIMPA1通过协调脱落酸（ABA）信号调控冠毒素（COR）诱导的气孔重开以抵御Pst DC3000

《The Plant Journal》：Nuclear importin α1 AtIMPA1 regulates stomatal reopening to defend against PstDC3000 by orchestrating ABA signaling

　　

核输入蛋白α（importin α）家族蛋白是运输特定抗病蛋白进入细胞核、使这些蛋白正常发挥功能的重要载体。然而，核输入蛋白α蛋白是否参与植物免疫仍不清楚。研究人员鉴定了一个在保卫细胞表达的蛋白核输入蛋白α1 AtIMPA1，其有助于对丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000）的抗性。当采用浸渍接种（dip-inoculation）Pst DC3000时，impa1突变体表现出易感性增加，并伴随由Pst DC3000分泌的植物毒素冠毒素（coronatine，COR）诱导的显著气孔重开；而过表达AtIMPA1增强了Pst DC3000抗性，并削弱COR诱导的气孔重开。值得注意的是，在注射侵染（syringe-infiltration）Pst DC3000后，impa1突变体表现出抗性增加，而过表达株系对Pst DC3000更敏感，表明COR触发的气孔重开是AtIMPA1介导抗病性的主要决定因素。进一步研究发现，AtIMPA1调控COR触发的气孔重开与脱落酸（abscisic acid，ABA）信号有关。AtIMPA1突变减弱了ABA介导的根长和种子萌发抑制，并破坏了ABA响应蛋白的ABA诱导蛋白丰度和定位，支持其在调控ABA响应中的作用。这些发现揭示了AtIMPA1在COR触发的气孔重开中的功能意义，并为核输入蛋白α蛋白如何协调ABA信号以调控植物免疫提供了新见解。

研究背景与问题：植物细菌侵染常从表面定殖开始，并经伤口和气孔进入，气孔关闭构成气孔免疫（stomatal immunity）；病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）如flg22可触发气孔关闭，而Pst DC3000分泌冠毒素（coronatine，COR）模拟茉莉酸-异亮氨酸（jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile），经COI1-JAZ、MYC2及NAC转录因子促进气孔重开。脱落酸（abscisic acid，ABA）在保卫细胞中促进气孔免疫，COR可抑制ABA信号并诱导已关闭气孔重开。核输入蛋白α（importin α）识别经典核定位信号（classical nuclear localization signal，cNLS），与核输入蛋白β（importin β）介导货物入核；但importin α是否参与植物免疫尚不清楚。拟南芥AtIMPA1虽被报道与AtKPNB1互作并参与ABA响应和耐旱，但其免疫功能不明。因此研究人员鉴定保卫细胞表达的AtIMPA1，解析其通过COR触发的气孔重开和ABA信号调控Pst DC3000抗性的作用，并认为该运输机制是精细调控植物抗病性的组成部分。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用拟南芥Col-0及来源为拟南芥生物资源中心（ABRC）的T-DNA插入突变体impa1-1（SALK_105557）和impa1-2（SALK_082616），并构建AtIMPA1过表达与互补株系；采用Pst DC3000、COR缺陷型Pst^?及hrcC^?进行浸渍和注射接种，测定病征与菌量；用气孔开度分析、逆转录定量PCR（RT-qPCR）、亚细胞定位、MAPK免疫印迹、胼胝质沉积、RNA-Seq、ABA定量、种子萌发和根长试验；用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）检测互作；并接种Sclerotinia sclerotiorum和Colletotrichum higginsianum。

研究结果：（1）AtIMPA1突变降低浸渍接种Pst DC3000抗性：通过T-DNA突变体、过表达和互补株系浸渍接种Pst DC3000，发现impa1病征和菌量增加，过表达株系抗性增强，互补株系恢复；AtIMPA1受诱导，PR1和NPR1在impa1中降低、过表达中升高，结论为AtIMPA1正调控Pst DC3000抗性并影响防御相关基因表达。（2）AtIMPA1介导含cNLS蛋白入核并在保卫细胞表达：通过cNLS-RFP核定位、AtIMPA1-GFP组织表达及原生质体和Nicotiana benthamiana共定位，发现impa1中cNLS-RFP核积累降低，AtIMPA1定位于核且在保卫细胞表达明显，结论为AtIMPA1介导含cNLS蛋白入核。（3）AtIMPA1过表达抑制COR触发的气孔重开：通过Pst DC3000、flg22、Pst^?和COR处理后的气孔开度分析，impa1在早期关闭略延迟但最终关闭，COR诱导重开在impa1中增强，过表达株系持续关闭或重开受损，结论为过表达AtIMPA1削弱COR触发的气孔重开。（4）AtIMPA1突变增强注射接种Pst DC3000抗性：通过注射接种绕过气孔，过表达株系更感病、impa1更抗；hrcC^?生长很差；flg22预处理后impa1菌量较低、过表达较高；MAPK中MPK3/MPK6磷酸化在impa1中较高、过表达中较低；胼胝质沉积在impa1中较多、过表达中较少，结论为AtIMPA1负调控基础及flg22触发的质外体防御。（5）AtIMPA1调控的COR触发气孔重开与ABA信号相关：通过RNA-Seq、ABA定量及ABA/氟啶酮处理气孔，差异表达基因富集于ABA响应，impa1中ABA积累较少、过表达中较多；过表达株系在Pst DC3000或ABA下保持关闭，氟啶酮预处理后过表达气孔打开，外源ABA可恢复关闭，结论为其与ABA信号关联。（6）AtIMPA1正调控ABA响应：通过种子萌发和根长试验，ABA处理下impa1萌发率较高、根较长，过表达萌发率较低、根较短，结论为AtIMPA1正调控ABA响应。（7）impa1突变体中过表达ABA响应基因AtARS1可部分恢复ABA不敏感和易病表型：通过AtARS1蛋白积累与定位、Y2H/BiFC/Co-IP及遗传过表达，impa1中ABA诱导的AtARS1积累和转位受损，但未检测到直接互作；ars1类似impa1易感；AtARS1-OE/impa1部分恢复抗性和ABA敏感性，结论为AtIMPA1位于AtARS1上游协调ABA信号与气孔免疫。（8）AtIMPA1参与ABA相关的植物对多种病原响应：通过接种S. sclerotiorum和C. higginsianum，impa1对S. sclerotiorum抗性增强、过表达抗性受损；对C. higginsianum则impa1抗性降低、过表达增强，结论为AtIMPA1参与ABA相关且依赖病原生活史的不同响应。

讨论与结论：讨论指出，AtIMPA1正调控Pst DC3000抗性，主要通过削弱ABA诱导的COR触发气孔重开来实现；其介导cNLS货物入核并主要定位于核，impa1中cNLS-RFP核积累下降。AtIMPA1与AtKPNB1在ABA表型上相反，提示二者可能具有独立或拮抗作用。AtARS1含cNLS并在ABA下向胞质和膜转位，impa1中该动态受损但无直接互作，AtARS1过表达可部分绕过AtIMPA1缺陷，表明AtARS1位于其下游。浸渍与注射接种表型相反，说明气孔免疫贡献占主导；hrcC^?不表现类似增强，提示涉及T3效应子介导的质外体免疫抑制。不同病原接种显示AtIMPA1并非广谱基础抗性，而是调控早期气孔免疫等响应。研究结论部分翻译为：综上所述，研究人员提出工作模型，核输入蛋白α1 AtIMPA1通过协调ABA信号调控气孔重开以抵御Pst DC3000；Pst DC3000感染触发ABA积累并诱导快速气孔关闭以限制病原进入，但Pst DC3000利用COR对抗ABA诱导的气孔关闭并促进已关闭气孔重开；在此背景下，AtIMPA1削弱COR触发的气孔重开，从而恢复气孔关闭；AtIMPA1调控ABA相关蛋白如AtARS1的表达水平，可能增强植物对病原的适应性；探索参与COR触发气孔重开过程并与AtIMPA1协同的货物蛋白，将为了解AtIMPA1在植物免疫中的作用提供更深入机制见解。