水稻进化保守F-box基因SDEF的自然变异通过增强脱落酸信号促进种子休眠并提升抗穗发芽育种潜力

《The Plant Journal》：Natural variation in the evolutionarily conserved F-box gene SDEF promotes seed dormancy in rice

　　

种子休眠不足会导致水稻穗发芽（pre-harvest sprouting，PHS）和严重产量损失；然而，具有实用育种价值的遗传资源仍然有限。在本研究中，研究人员利用染色体单片段代换系（single segment substitution lines，SSSLs）进行图位克隆（map-based cloning），分离到一个主要休眠基因SDEF，并鉴定出一个功能性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）（Arg-to-Trp）为因果突变。CRISPR/Cas9介导的SDEF敲除导致PHS易感，而过表达则显著增强休眠。重要的是，SDEF在SSSLs中增强种子休眠而不损害籽粒产量，证实其是有前景的育种靶标。此外，SDEF编码一个被子植物保守的、核定位的F-box蛋白，并优先在胚中表达，其表达在种子成熟过程中升高、在萌发时下降。机制上，蛋白互作实验证实SDEF招募OSK1，且Trp型SDEF^K较Arg型SDEF^H具有更稳定的互作。SDEF受脱落酸（abscisic acid，ABA）诱导，并似乎通过ABA途径激活ABA信号基因、抑制α-淀粉酶（α-amylase）基因来促进种子休眠，证据为sdef突变体ABA敏感性降低。此外，单倍型分析显示SDEF的自然变异与不同休眠水平相关，栽培稻中核苷酸多样性降低表明SDEF在驯化过程中受到选择。总体而言，研究结果提供了对SDEF介导休眠分子基础的见解，为培育抗PHS水稻提供了理想靶标。

研究背景与意义：种子休眠是植物生命周期中精确调控萌发时机的重要性状。水稻驯化过程中休眠受到负选择，导致栽培稻休眠水平降低，易在母株上发生穗发芽（pre-harvest sprouting，PHS），造成产量与品质损失；该问题对中国杂交稻尤为突出。适度种子休眠既可保证播种后快速整齐出苗，又可降低PHS风险，因此解析休眠自然变异及其调控机制是水稻育种的重要目标。种子休眠受多基因和环境共同影响，脱落酸（abscisic acid，ABA）与赤霉素（gibberellic acid，GA）是核心激素网络；已鉴定200余个与水稻种子休眠和PHS相关的数量性状位点（quantitative trait locus，QTL），但克隆并功能研究者有限，具有实用抗PHS价值的基因资源仍不足。F-box蛋白通过形成SKP1-Cullin-F-box（SCF）E3泛素连接酶参与泛素-26S蛋白酶体途径，是翻译后调控的重要节点；水稻有779个F-box基因，但多数功能未知，尤其在种子休眠中的作用尚待阐明。基于前期用单片段代换系（single segment substitution lines，SSSLs）将主效位点qSD7-1定位于355-kb区间，研究人员开展图位克隆和功能解析，以明确其育种价值。

研究人员开展了什么研究、结论及意义：研究人员从Khazar（japonica）和Jasmine（indica）来源的SSSLs中构建近等基因系（near-isogenic lines，NILs）NIL-K和NIL-J，克隆到SDEF，鉴定第457位C-to-T导致Arg-to-Trp（R153W）为因果变异；通过CRISPR/Cas9敲除和过表达证明SDEF正调控种子休眠，敲除导致PHS易感、过表达增强休眠，且在SSSLs中不造成最终单株产量显著损失；进一步证明SDEF与OSK1互作、通过增强ABA信号途径发挥作用，并揭示其在驯化中受到选择。该研究为抗PHS水稻育种提供了具应用潜力的靶标。

关键技术方法概述：研究以Khazar（japonica）、Jasmine（indica）为供体、HJX74（indica）为轮回亲本构建SSSLs及NIL-K/NIL-J；利用F₂/F₃重组体进行图位克隆，并结合混合分组分析法测序（bulk segregant analysis sequencing，BSA-seq）定位；多环境评价新鲜种子或穗的发芽及50°C 7 d休眠释放；在NIL-K/NIL-J背景进行CRISPR/Cas9敲除、在HJX74背景过表达；采用qRT-PCR、GUS染色、亚细胞定位、酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）、pull-down、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）、转录组测序（RNA-seq）及ABA/IAA测定；单倍型和核苷酸多样性分析利用3K水稻数据库及ECOGEMS中2058份材料（446份野生、1612份栽培），种质来自中国农业科学院和华南农业大学农学院。

研究结果：
qSD7-1是控制种子休眠的主效QTL：通过NIL-K和NIL-J在多环境下的新鲜种子/穗发芽试验，发现二者休眠显著强于HJX74；休眠释放后萌发率均接近100%；NIL-K×HJX74的F₂群体强/弱休眠分离符合3:1，且具加性—显性效应，表明qSD7-1为单显性主效位点。
SDEF的图位克隆：利用NIL-K×HJX74的F₂及3580个F₃重组体、7个分子标记和替换作图，将qSD7-1限定于48.9-kb区间内的9个预测基因；比较测序发现ORF6第457位C-to-T造成Arg-to-Trp，NIL-J的BSA-seq亦检测到同一SNP；ORF6在种子中高表达，被命名为SDEF（LOC_Os07g07520），编码249个氨基酸的F-box蛋白。
SDEF促进种子休眠：在NIL-K和NIL-J背景经CRISPR/Cas9敲除SDEF产生移码和蛋白截短，突变体新鲜穗/种子萌发率显著升高，休眠释放后与对照无差异；在HJX74过表达SDEF^K后，多个生长季新鲜穗休眠显著增强；NIL-K和NIL-J最终单株产量与HJX74无显著差异，但株高和每穗粒数增加、粒长和千粒重降低。
SDEF主要在胚中表达：序列分析显示SDEF含N端F-box样结构域（48–83位），在被子植物中保守、在Poaceae中同源性超过80%；RiceXPro、qRT-PCR和pSDEF::GUS分析显示其在胚中优势表达，种子发育至20 DAP达峰值，吸胀后HJX74中表达下降而NIL-J/NIL-K中保持较高；SDEF-GFP与核标记共定位，表明其为核定位蛋白。
SDEF与OSK1（SCF型E3泛素连接酶组分）互作：Y2H、pull-down和BiFC实验显示SDEF全长及N端片段与OSK1互作；SDEF^K与OSK1形成稳定互作，而SDEF^H在植物细胞中未见可见BiFC信号；OSK1与Cullin互作而SDEF不与Cullin直接互作，支持典型SCF组装模式；F-box结构域对SDEF与OSK1稳定互作必需。
SDEF通过增强ABA信号途径促进种子休眠：对吸胀24 h种子进行RNA-seq，NIL-J相对HJX74鉴定到146个上调、149个下调基因；ABA信号正调控基因OsVP1、OsbZIP10、Sdr4和OsMFT2表达升高，α-淀粉酶基因表达降低，qRT-PCR确认该趋势；NIL-K在20 DAP的ABA含量较高，IAA在10–30 DAP持续升高；NIL-J较sdefNJ对10 μM ABA更敏感，15 μM ABA诱导SDEF表达；研究人员提出SDEF与OSK1、Cullin形成SCF^SDEF复合体，可能通过泛素化未知底物增强ABA响应。
SDEF自然变异与种子休眠相关：利用3K水稻数据库的1-kb启动子和编码区6个SNP定义5个主要单倍型，Hap1为优势单倍型（2088份材料），Hap2–Hap5稀有；发芽试验显示Hap1、Hap3、Hap4休眠较弱（2022L平均萌发率32%、42%、44%），Hap2和Hap5休眠较强（4%、9%）；457-C稀有等位（11份）与Hap1休眠无显著差异；系统发育显示Hap2较分化；栽培稻SDEF位点核苷酸多样性π由野生稻0.1399降至indica 0.0094、japonica 0.0030，降低超过14倍，支持驯化选择。

讨论总结与结论翻译：讨论指出，SDEF是被子植物高度保守的F-box基因，R153W可能增强SDEF-OSK1组装，从而经SCF复合体增强休眠；SDEF更可能是ABA信号途径关键节点而非ABA生物合成调控因子，并可整合IAA信号；Hap1弱休眠与水稻驯化中快速整齐萌发的人工选择一致，Hap2/Hap5为抗PHS改良的稀有强休眠资源；由于自然群体中SDEF效应受背景和上位性影响，未来育种宜多基因聚合。研究结论翻译：总之，SDEF是一个在驯化过程中受选择的被子植物保守F-box基因，据推测通过SCF^SDEF复合体促进种子休眠，可能通过协调ABA信号和淀粉动员实现。这些结果为一种独特的休眠机制提供了见解，并突出SDEF作为培育抗PHS品种的有价值靶标。未来鉴定SCF^SDEF底物并阐明SDEF介导的IAA-ABA互作，将进一步推进对种子休眠调控的理解并指导作物改良策略。