《The Plant Journal》：Single-cell transcriptome atlas reveals a WRKY33-HSP81 regulatory module that orchestrates phenylpropanoid-mediated defense against Sclerotium rolfsii in Dendrobium officinale
编辑推荐：
植物利用细胞类型特异性转录程序抵御病原体，然而药用兰科植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）免疫应答的细胞异质性仍 largely 未被解析。研究人员构建了铁皮石斛茎基部响应Sclerotium rolfsii
植物利用细胞类型特异性转录程序抵御病原体，然而药用兰科植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）免疫应答的细胞异质性仍 largely 未被解析。研究人员构建了铁皮石斛茎基部响应Sclerotium rolfsii感染的scRNA-seq图谱，在感染后12和24 h（hours post-infection, hpi）分析了超过20 000个细胞。共解析21个细胞簇，并归为6种主要细胞类型——表皮细胞、薄壁组织细胞（ground tissue parenchyma）、增殖细胞、木质部细胞、韧皮部细胞和维管束薄壁细胞，其身份经荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）验证。细胞类型特异性分析显示，表皮细胞和韧皮部细胞启动早期防御反应，而木质部细胞在24 hpi表现出最广泛的转录重编程，并与木质素生物合成通路激活同时发生。WRKY33被鉴定为核心转录激活因子，直接结合木质素生物合成基因C4H和HCT启动子中的W-box基序，促进木质素沉积并增强抗病性。相反，核定位伴侣蛋白HSP81与WRKY33发生物理互作，并通过辅因子隔离作为多种转录因子的广泛调节因子，从而在过表达时削弱防御。这些发现揭示了一个WRKY33-HSP81调控模块，协调铁皮石斛中苯丙烷类介导的防御，为理解植物免疫提供了高分辨率细胞框架，并为提高该具有经济价值物种的抗病性提供了潜在靶点。
研究背景：铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为珍稀濒危兰科药用植物，兼具观赏和药用价值；人工栽培中易受多种病害威胁，其中南方立枯病（southern blight，又称白绢病或菌核病）是重要威胁，主要病原包括Sclerotium rolfsii Sacc.和Sclerotium delphinii Welch。S. rolfsii为坏死营养型真菌，在高温高湿条件下感染力强。木质素（lignin）是植物细胞壁主要成分，病原侵染后细胞壁木质化程度增加，可增强机械强度并抵抗病原释放的细胞壁降解酶；转录因子（transcription factors, TFs）参与植物抗病信号通路，但铁皮石斛抗S. rolfsii的木质素分子机制、哪些TFs调控木质素合成关键酶基因及是否通过一个或多个关键酶基因增强抗性尚不清楚。WRKY类TF可通过结合防御基因启动子中的W-box元件调控植物免疫，WRKY33在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中被表征为camalexin生物合成和抗坏死营养型病原的核心调控因子，但其在铁皮石斛等非模式药用植物中的功能 largely 未明；HSP90（heat shock protein 90）家族为分子伴侣，参与蛋白质折叠、稳定性和胁迫响应，并可通过与NBS-LRR抗病蛋白和TFs等客户蛋白互作参与植物免疫，但其在核内直接调节TF活性和防御基因表达的功能仍不清楚。细胞在植物生长发育和逆境响应中具有关键作用，scRNA-seq可解析复杂组织细胞异质性并识别未知细胞类型，已用于植物—微生物互作研究；对病原侵染下植物组织进行单细胞转录组分析有助于识别参与免疫抗性通路的主要细胞群。基于此，研究人员构建铁皮石斛茎基部响应S. rolfsii感染的scRNA-seq图谱，解析6种主要细胞类型及其在感染早期和晚期动态转录变化，发现WRKY33和HSP81（HSP90家族）在病原防御中具有相反功能，并受木质素和黄酮生物合成基因差异调控；进一步证明WRKY33通过结合W-box直接激活木质素生物合成基因C4H和HCT，WRKY33与HSP81在核内物理互作，形成整合生物与非生物胁迫信号的多层调控网络。该研究建立了WRKY33-HSP81调控模块协调铁皮石斛苯丙烷类介导抗S. rolfsii防御，为植物胁迫响应提供新见解，并为抗病遗传改良提供潜在靶点。
关键技术与方法：研究人员以1年生组织培养铁皮石斛幼苗为材料，茎基部接种5 mm S. rolfsii菌饼，于0、12和24 hpi取样；S. rolfsii菌株由南京农业大学生命科学学院教授实验室提供。采用10× Genomics平台对茎基部原生质体进行scRNA-seq，并以FISH验证标记基因；开展Bulk RNA-seq、加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）及基于HMM的TF家族鉴定；通过过表达结合定量PCR（quantitative PCR, qPCR）、酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）、酵母单杂交（yeast one-hybrid, Y1H）、电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、亚细胞定位、Wiesner染色和乙酰溴法木质素含量测定验证WRKY33-HSP81功能及C4H/HCT调控。
研究结果：
1. 铁皮石斛茎基部细胞转录组图谱的构建：通过10× Genomics scRNA-seq获得CK、12 hpi和24 hpi单细胞转录组，质控后分别检测9136、6355和8378个细胞，数据质量高；经主成分分析（principal component analysis, PCA）降维和聚类、均匀流形近似与投影（uniform manifold approximation and projection, UMAP）可视化获得21个细胞簇，基于水稻和拟南芥同源标记基因注释为6种细胞类型，FISH验证Dof023383、Dof009146、Dof019373和Dof015620分别为韧皮部细胞、表皮细胞、木质部细胞和增殖细胞标记基因。
2. 铁皮石斛茎基部的单细胞异质性分析：比较CK、12 hpi和24 hpi细胞类型比例发现茎基部对S. rolfsii刺激有明显响应；木质部细胞和增殖细胞表达模式逐渐下降，表皮细胞和韧皮部细胞在24 h显著减少；木质部细胞差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）数量显著高于其他5类细胞，多数DEGs主要发生于单一细胞类型。
3. 不同细胞类型响应病原感染的表达模式：GO和KEGG分析显示12 hpi表皮细胞、韧皮部细胞和薄壁组织细胞富集真菌防御响应和糖酵解过程；24 hpi六类细胞富集真菌防御响应，增殖细胞富集过氧化氢（H
2O
2）响应；12和24 hpi六类细胞中蛋白质折叠和细胞氧化应激响应显著下调；核糖体通路在12和24 hpi显著下调，24 hpi植物—病原互作通路显著上调。
4. 铁皮石斛受S. rolfsii感染不同阶段五类细胞的细胞轨迹分析：对木质部细胞、韧皮部细胞、增殖细胞、表皮细胞和维管束薄壁细胞进行拟时间轨迹分析，轨迹包含3种状态；随处理时间增加，细胞逐渐从状态3和2向状态1移动；防御响应、茉莉酸介导信号、脱落酸激活信号和信号受体活性等通路集中于cluster 2和4并呈上升趋势。
5. S. rolfsii处理下铁皮石斛基因的WGCNA：利用WGCNA从CK、T_12h和T_24h转录组DEGs中鉴定4个模块，样本聚类正常，未检测到异常基因。
6. 与生物胁迫相关转录因子的表达模式：Bulk RNA-seq显示NBS、HSP90、bZIP、WRKY、VQ和NAC等多个TF家族在12和24 hpi显著上调；HSP81（Dof002881）在木质部细胞中占优并随时间稳步增加，WRKY33（Dof014177）在12和24 hpi较对照明显升高，VQ成员Dof018941在木质部细胞组织特异性上调，MYB78（Dof013141）在多种细胞类型上调，bHLH35（Dof006253）在处理中先降后升。
7. 苯丙烷类生物合成通路的调控：苯丙烷类通路分为黄酮和木质素两个分支；鉴定6个黄酮生物合成关键DEGs（包括CHS、CHI、F3H、DFR和ANS）及30个木质素生物合成关键DEGs（包括4CL、COMT、CCR、CAD、C4H、HCT、F5H和peroxidase）；CHI（Dof014385）在12 h上调、24 h下调，C4H（Dof003361）在12 hpi韧皮部和表皮细胞高表达；4CL、CCR、C4H、HCT、F5H和peroxidase在处理中呈上升趋势；GO富集显示这些DEGs涉及苯丙烷代谢、对外部刺激响应、转移酶活性和植物型细胞壁等类别。
8. WRKY33增强病原抗性而HSP81通过差异调控苯丙烷类通路基因削弱防御：在铁皮石斛叶片分别过表达WRKY33和HSP81后接种S. rolfsii，WRKY33过表达叶片病斑面积显著小于对照，HSP81过表达叶片病斑面积显著增大；qPCR显示WRKY33过表达上调木质素相关C4H、HCT和COMT，下调4CL、CHS、F3H和DFR；HSP81过表达下调4CL、CHI、CAD、F5H和peroxidase（Dof022187），上调DFR和HCT，C4H无显著变化。
9. 多层蛋白质–蛋白质相互作用网络介导铁皮石斛协同胁迫响应：蛋白质—蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络分析显示以HSP81、WRKY33和LTI65为中心的调控模块；Y2H验证HSP81与WRKY33物理互作，WRKY33与LTI65互作，提示这些TFs协同整合多种胁迫信号通路。
10. HSP81和WRKY33的专一核定位提示其转录调控作用：在Nicotiana benthamiana表皮细胞中瞬时表达HSP81-GFP和WRKY33-GFP，二者均专一核定位，提示其在核内参与转录程序调控。
11. WRKY33直接结合并激活C4H和HCT启动子转录：Y1H显示WRKY33对proC4H和proHCT产生阳性颜色反应，EMSA显示WRKY33-GST特异性结合C4H和HCT启动子中的W-box序列，证明WRKY33直接调控这两个基因。
12. WRKY33调控木质素合成：Wiesner染色显示WRKY33过表达茎横切维管束红色更深，乙酰溴法测定WRKY33过表达茎木质素含量为11.04%，显著高于对照的9.67%，证明WRKY33正向调控木质素生物合成。
讨论总结与结论翻译：讨论指出，该研究从铁皮石斛茎基部分离高质量原生质体并构建首个单细胞转录组图谱，解析21个细胞簇并归为6种主要细胞类型，结合拟南芥和水稻已知标记基因及茎横切解剖特征注释，FISH验证韧皮部细胞、表皮细胞、木质部细胞和增殖细胞标记基因；这一标记基因库为后续功能研究、次生代谢、发育和胁迫响应候选基因研究提供资源。对S. rolfsii感染的细胞类型特异性响应显示，表皮细胞作为最外层且具疏水角质层，是病原防御第一道屏障；24 hpi表皮细胞丰度降低可能反映其作为前线防御者发生程序性细胞死亡以限制病原扩散；维管束由木质部和韧皮部组成，参与水分和养分运输、抗菌物质（包括酚类化合物和抗菌蛋白）转运及免疫信号转导，韧皮部细胞丰度降低可能反映后期感染中韧皮部信号和资源分配动态；表皮细胞与维管束协同作用，通过木质化增强细胞壁刚性并限制病原扩散。关于HSP81，讨论提出其专一核定位使其可能除WRKY33外还互作多种核内客户蛋白；HSP81过表达与WRKY33过表达呈现非互为反向的基因表达谱，HSP81上调DFR和HCT而WRKY33分别下调DFR和上调HCT，HSP81还下调4CL、CHI、CAD、F5H和peroxidase等基因，这些差异不能用简单的WRKY33抑制模型解释，提示HSP81通过共调节因子竞争广泛、基因特异性地调控多个TFs；讨论还提及NAC-MYB模块及MYB26、MYB46、MYB63、MYB85、MYB103等参与木质素生物合成，MYB类也调控DFR、ANS和ANR等黄酮生物合成，WRKY和bZIP等可能影响木质素与黄酮分支代谢流平衡；本研究中MYB78过表达显著上调木质素和黄酮生物合成关键酶基因并与病原抗性增强相关。结论翻译：总之，HSP81并非仅作为WRKY33的专一性抑制剂，而似乎作为一个核内隔离枢纽，通过调控对有限共调控资源的可及性来调节多种TFs的活性；这一观点将HSP81从被动的分子伴侣提升为控制植物防御代谢的复杂转录调控网络中的主动参与者。
