扩展釉原蛋白肽面板以弥补牙釉质性别判定中的靶标特异性丢失

《Methods》：Expanding amelogenin peptide panels to address target-specific loss in enamel-based sex determination

　　

现代考古研究中应用的蛋白质组学（proteomics）能够以极高灵敏度从微量样本中检测相关分子信息，并在形态学或基于DNA的方法失败时提供可靠信息。此类应用之一是使用牙釉质（tooth enamel）的蛋白质组学分析进行性别判定。釉原蛋白（amelogenin）是牙釉质中最丰富的蛋白质之一。在包括人类在内的许多哺乳动物中，其对应基因位于性染色体上，因而形成X和Y同工型（isoforms），其中后者为男性特异。当前靶向蛋白质组学（targeted proteomics）分析方法使用来自酪氨酸富集釉原蛋白肽（tyrosine-rich amelogenin peptide, TRAP）区域的肽段，该区域包含同工型特异性氨基酸基序。在本研究中，研究人员调查了100颗牙齿，其中91颗来自亚成年人，9颗来自保存较差的成年骨架，这些样本出土于丹麦Virklund的一处中世纪晚期埋葬遗址。使用既有的仅靶向TRAP的靶向蛋白质组学方法进行的初步分析显示，11个样本的AMELX（X染色体釉原蛋白）肽段检测降低或缺失（5个完全缺失，6个仅检测到单个肽段），导致低置信度或不确定的分类。利用发现蛋白质组学（discovery proteomics），研究人员用两个针对AMELX C端结构域（C-terminal domain）的特异性肽段扩展了肽面板（peptide panel）。纳入这些肽段后，所有先前不确定的病例均恢复了有置信度的性别判定，且未损害分析性能或灵敏度。这表明釉原蛋白的C端区域可作为稳定且具诊断价值的肽标志物来源。更广泛地，扩展肽面板的成功凸显了发现蛋白质组学与靶向蛋白质组学在适应考古牙釉质样本中样本依赖性变异方面的协同价值。

研究背景与问题：考古蛋白质组学（archaeological proteomics）可在DNA高度降解时提供分子信息，牙釉质因高度矿化且耐成岩作用（diagenesis）而成为蛋白质保存的重要材料。釉原蛋白（amelogenin）由性染色体上的AMELX和AMELY编码，AMELY特异性肽段可指示男性，AMELX肽段在两性中均存在。既有基于牙釉质的靶向蛋白质组学（targeted proteomics）性别判定主要依赖酪氨酸富集釉原蛋白肽（TRAP）区域肽段；但靶向方法仅检测预设肽段，当样本中这些肽段未检出时会产生不明确结果。釉原蛋白在釉质成熟过程中受内源性蛋白酶加工，且考古样本存在样本依赖性变异，因此固定肽面板可能在某些考古组合中失效。本研究旨在检验TRAP-only面板在 medieval 牙釉质样本中的表现，并利用发现蛋白质组学（discovery proteomics）寻找补充肽段以扩展面板。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员分析丹麦Virklund中世纪晚期墓地出土的100颗牙齿，先以既有TRAP-only靶向面板进行性别判定，再对不明确样本开展发现蛋白质组学，识别AMELX C端高频高丰度肽段，并将其加入靶向面板。结果显示，扩展面板可在不损害分析性能或灵敏度的情况下，使所有先前不明确病例恢复有置信度的性别判定。研究结论支持釉原蛋白C端区域作为稳定且具诊断价值的肽标志物来源，并表明发现与靶向蛋白质组学结合可适应考古牙釉质样本的样本依赖性变异。

关键技术方法（不超过250字）：样本来自丹麦Virklund中世纪晚期墓地（Museum Silkeborg于2023年发掘；共445座墓，其中121座亚成年人墓），本研究分析100颗中世纪牙齿（91颗亚成年人，9颗保存较差成年骨架）。研究人员采用牙釉质酸蚀取样，EvoTip加载，EvoSep One液相色谱分离；靶向蛋白质组学采用并行反应监测（parallel reaction monitoring, PRM）在Orbitrap Exploris 480上分析，发现蛋白质组学采用数据依赖采集（data-dependent acquisition, DDA）在Orbitrap Astral上分析；靶向数据用Skyline处理，发现数据用FragPipe、MSFragger和IonQuant处理，并进行开放修饰搜索和单氨基酸变异（single amino acid variants, SAAVs）数据库搜索。

2. Results and discussion（结果与讨论）
通过初始TRAP-only靶向蛋白质组学分析100颗中世纪牙齿，研究人员发现多数样本可获得清晰信号，但22例结果不明确；其中11例表现为AMELX TRAP肽检测减少或缺失（5例完全缺失，6例仅检测到单个肽段），导致低置信度或不确定分类，另有3例仍可 readily 检测到AMELY肽段，提示釉原蛋白内部存在区域特异性肽丢失而非全局分析信号丧失。通过开放修饰搜索，研究人员观察到常见修饰包括甲硫氨酸和脯氨酸单氧化、丝氨酸/苏氨酸磷酸化、谷氨酰胺/天冬酰胺脱酰胺、N端焦谷氨酸形成、色氨酸氧化及二脱水交联等；不明确组的氧化水平总体较高，但修饰谱恒定，甲硫氨酸和脯氨酸氧化在总数据中为20–60%，在AMELX/Y肽中为10–30%，其他修饰相对少见，难以解释AMELX肽不可检测。通过样本特异性数据库并补充Uniprot中AMELX和AMELY的SAAVs（45条蛋白序列，共88条）搜索，匹配SAAV的肽几乎均为修饰形式，仅一个未修饰例外；未修饰变体接近缺失提示假阳性，且开放修饰搜索未报告合适质量偏移，因而未提供未知化学修饰或高丰度遗传变异主导该现象的证据。随后数据库搜索限定为参考人类蛋白质组及常见修饰。

通过发现蛋白质组学分析，研究人员鉴定43种蛋白，AMELX为最丰富蛋白，占总离子丰度50%以上，通常依次为ameloblastin和enamelin，AMELY在检出样本中通常排第4或更低、占总丰度不到3%；该分析可靠判定所有初始不明确样本的性别，最低肽产量样本A440-X221仍鉴定9条独特AMELX肽和2条独特AMELY肽，其他样本可获数十至上百条同工型特异性肽。通过肽段覆盖度分析，研究人员发现多数检出肽属于TRAP区域，但C端结构域由许多高丰度肽覆盖；TRAP C端含AMELY Met59和Ser65等性别特异变化，C端结构域含Ala196和Gln202等性别特异变化，即使TRAP区域性别特异肽代表性不足，C端强覆盖仍足以可靠判定性别。通过比较Koenig et al.的发现蛋白质组学数据，研究人员指出AMELX C端肽在TRAP覆盖降低时仍常以可观丰度出现：22例不明确样本中超过四分之一AMELX肽属于C端区域，通常超过40%，17例中最丰富AMELX C端肽位于全部检出肽MS丰度前10%；AMELY C端肽在9/11样本中超过四分之一AMELY肽映射至C端，7例中最强C端肽位于前25%（其中2例前10%）。在Koenig et al.分析的42例发现数据中，40例AMELX C端肽比例高于25%，21例最丰富C端肽位于前10%，现代样本中AMELX C端肽位于前4%；AMELY在8/18例中C端肽贡献超过25%，最丰富C端肽位于前25%。基于此，研究人员建议将两个AMELX C端特异肽STDKTKREEVD（3⁺）和DKTKREEVD（2⁺）加入靶向面板；AMELY C端对应区域含Gln而非Arg，可样本特异性脱酰胺为Glu，使总肽丰度分配于天然与脱酰胺形式，降低 assay 可靠性，故未纳入AMELY C端肽。

通过扩展面板靶向分析，研究人员使用四条AMELX特异肽（两条TRAP、两条C端）和三条AMELY特异肽（均TRAP）分析全部样本；以Skyline计算的片段强度点积（fragment intensity-dot-product）>0.8为可靠肽鉴定阈值，可完全区分男女样本。参考样本中所有样本检出三或四条AMELX肽，男性样本检出三条AMELY肽，AMELX和AMELY的汇总肽丰度通常≥10⁸；观察到的AMELX:AMELY丰度比通常为2:1–4:1，而非常引用的十倍差异。不明确样本通常每个蛋白检出三或四条肽，最不利病例仅检出两条AMELX肽和一条AMELY肽，丰度较低（>10⁷）但仍足以置信判定；先前成功样本的准确性未受更长MS采集周期影响。扩展 assay 的平均每峰点数和片段强度平均点积与初始 assay 相近，而不明确样本的成功检出肽数显著改善。讨论总结认为，样本依赖性釉原蛋白肽可检测性变异会实质影响靶向蛋白质组学性别判定性能，且无法对考古样本先验预测，因此需要更广泛、更有韧性的肽靶面板；TRAP-only面板在若干考古背景中可靠，但当AMELX TRAP肽未检出时效果有限。

4. Conclusion（结论）
本研究证明，釉原蛋白肽可检测性的样本依赖性变异可实质影响基于靶向蛋白质组学的性别判定性能。由于此类变异无法对考古样本先验预测，研究结果凸显了在质谱工作流程中采用更广泛且更有韧性的肽靶面板的必要性。尽管既有TRAP为基础的面板在若干考古背景中提供了可靠结果，但研究表明，当个别标本中未检出AMELX TRAP肽时，其有效性受限。对100颗中世纪牙齿使用TRAP-only肽面板的靶向蛋白质组学分析显示，11个样本AMELX TRAP肽检测减少或缺失，导致低置信度或不明确分类；其中3个样本仍 readily 检测到AMELY肽，表明釉原蛋白内部存在区域特异性肽丢失而非全局分析信号丧失。这些观察强调肽回收的样本依赖性变异，并揭示TRAP-only靶向蛋白质组学 assay 在某些标本中的实际脆弱性。利用发现蛋白质组学，研究人员鉴定出两个常被检出的AMELX C端肽，包括在TRAP衍生肽缺失样本中；将这些肽纳入扩展肽面板后，所有先前不明确病例均恢复有置信度的性别判定，且未损害分析性能或灵敏度。这表明此前利用不足的釉原蛋白C端区域在所研究考古背景中代表稳定且具诊断价值的肽标志物来源。由于本研究限于单一考古遗址，所建议肽面板的普适性应在更广泛多样的考古材料中评估。更广泛地，扩展面板的成功凸显了结合发现与靶向蛋白质组学以适应考古牙釉质样本依赖性变异的价值。尽管发现蛋白质组学已在开发当前用于靶向蛋白质组学性别判定的肽面板中发挥核心作用，但研究结果显示，保存的肽库可因遗址和埋葬环境而显著不同。这种背景依赖性意味着，即使经过良好验证的面板在应用于新组合时也可能需要改进。通过提供来自釉原蛋白C端的额外稳健标志物，本研究支持更灵活、更有韧性的基于牙釉质性别判定框架，在骨学或遗传学方法受限时加强人口统计学重建。