长期全身性非甾体抗炎药治疗降低马固态富血小板纤维蛋白（PRF）中TGF-β1、PDGF与VEGF-A浓度：血浆与固态PRF联合或可最大化生长因子与细胞因子递送

《Equine Veterinary Journal》：The influence of a systemic non-steroidal anti-inflammatory drug on growth factors and cytokines in equine plasma, solid platelet-rich fibrin (PRF), and liquid PRF

背景：富血小板纤维蛋白（PRF；platelet-rich fibrin）是一种第二代血小板浓缩物，其纤维蛋白基质内含有生长因子和细胞因子，可实现 prolonged release（延长释放），并支持其作为角膜创口愈合再生治疗的用途。患有溃疡性角膜炎的马常接受全身性非甾体抗炎药（NSAIDs；non-steroidal anti-inflammatory drugs）治疗；因此，确定长期使用氟尼辛葡甲胺是否会改变PRF或血浆的组成具有临床重要性。目的：评价全身性NSAID给药对马血浆、固态PRF和液态PRF中生物分析物浓度的影响，并比较这些浓度在不同血液制品间的差异。研究设计：前瞻性、横断面研究。方法：将马纳入两组：接受全身性全剂量氟尼辛葡甲胺（1.1 mg/kg BID）治疗三日或以上的马（NSAID组），以及至少三个月未暴露于NSAID的马（对照组）。血浆和PRF制备遵循标准方案，生长因子和细胞因子浓度采用多重免疫分析或ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验）定量。血浆中氟尼辛葡甲胺浓度通过LC–MS/MS（liquid chromatography–tandem mass spectrometry，液相色谱–串联质谱）测定。对治疗组间（NSAID组 vs. 对照组）以及不同血液制品间分析物浓度差异进行统计学比较；p < 0.05视为显著。结果：NSAID组：n = 12匹马；对照组：n = 12匹马。与NSAID组相比，对照组固态PRF中TGF-β₁、PDGF和VEGF-A浓度显著更高。对三种血液制品的分析显示，血浆中TGF-β₁和TGF-β₂浓度显著更高，而固态PRF中PDGF、IL-₁β、IL-₄和TNF-α浓度显著更高。主要局限性：样本量小，且对马的代谢和内分泌状态表征不完整。结论：全身性NSAID给药似乎会降低固态PRF中关键生长因子的浓度。联合使用血浆和固态PRF可能最大化所评估生长因子和细胞因子的递送。

## 论文主体解读

自体血小板浓缩物（APC；autologous platelet concentrate）因具有再生和创口愈合特性而在人类与兽医医学中受到关注。血小板通过释放生长因子和细胞因子促进细胞迁移、增殖和血管生成，在止血和早期组织修复中发挥关键作用；APC的治疗目标即提高这些介质的局部浓度以加速愈合。富血小板血浆（PRP；platelet-rich plasma）作为第一代APC，在兽医医学中已广泛用于马肌腱和韧带损伤，但其需要抗凝剂和激活剂等添加剂，可能引起炎症，且注射后多数生长因子和细胞因子在数秒内释放。为简化PRP方案并延长释放，研究人员开发了富血小板纤维蛋白（PRF；platelet-rich fibrin），其由含白细胞和血小板的纤维蛋白基质构成，使用无添加剂采血管制备，并采用低相对离心力方案以形成有利于生长因子和细胞因子形成的环境。与PRF创口愈合效应最常相关的生长因子包括转化生长因子-β₁（TGF-β₁；transforming growth factor-β₁）、血小板源性生长因子（PDGF；platelet-derived growth factor）和血管内皮生长因子-A（VEGF-A；vascular endothelial growth factor-A），这些因子参与角膜上皮增殖、胶原合成、间充质细胞增殖与迁移以及血管生成。PRF还含有促炎细胞因子，包括白细胞介素（IL；interleukin）-₁β、IL-₄、IL-₆和肿瘤坏死因子-α（TNF-α；tumour necrosis factor-α），支持白细胞募集、血管生成、创口愈合和感染消退。得益于纤维蛋白基质，PRF中的生长因子和细胞因子可在7至10天内释放，因此适用于预计角膜愈合需数周的病例。近年来，PRF已成为兽医眼科的一种新型再生疗法，可制成液态PRF或纤维蛋白凝块（固态PRF），用于局部、结膜下和手术应用；其在马、驴和犬溃疡性角膜炎中显示缩短愈合时间的前景，并已在犬角膜重建手术中成功使用。尽管临床研究增加，但影响PRF生物学组成的全身性因素仍认识不足。患溃疡性角膜炎的马常接受全身性NSAID以减轻疼痛和眼内炎症。既往评估全身性NSAID对血清、血浆和PRP中生长因子浓度影响的研究结果不一致，且尚无研究专门评估长期全身性NSAID治疗对PRF组成的影响。因此，确定全身性NSAID使用是否削弱PRF治疗潜力具有临床重要性；理解这一相互作用可能影响临床决策，包括在接受长期NSAID治疗的马中考虑异体PRF和/或血浆。本研究目的是评价长期使用全身性NSAID氟尼辛葡甲胺对血浆以及两种PRF（液态和固态）中生长因子和细胞因子浓度的影响。

研究人员开展了前瞻性、横断面研究，将马分为NSAID组和对照组。NSAID组为NCSU Equine Ophthalmology service的客户所有患者，全身健康、2至25岁、具有单次采血所需性情，接受全身性氟尼辛葡甲胺1.1 mg/kg每日两次（BID；bis in die）静脉或口服治疗≥3天；氟尼辛葡甲胺主要经口服给药，部分马在操作前已有静脉导管时接受间歇性静脉给药，但无马仅经静脉途径接受氟尼辛葡甲胺。对照组为NCSU拥有的研究马，全身健康、2至25岁，入组前3个月内未接受全身性NSAID。所有马均进行体格检查、全血细胞计数和生化检查以确认总体健康；对照组要求纤维蛋白原浓度和血小板计数在北卡罗来纳州立大学临床病理实验室参考区间内。研究得出结论：全身性NSAID给药似乎降低固态PRF中关键生长因子浓度；联合使用血浆和固态PRF可能最大化所评估生长因子和细胞因子的递送。该研究意义在于提示长期接受全身性NSAID的马使用血小板浓缩物治疗时，固态PRF的某些生物活性可能受影响，并支持考虑血浆与固态PRF联合应用。

关键技术方法概括（≤250字）：本研究为前瞻性、横断面研究，纳入NSAID组12匹客户所有马（来源：NCSU Equine Ophthalmology service）和对照组12匹大学所有研究马（来源：NCSU owned research horses）。NSAID组接受全身性氟尼辛葡甲胺1.1 mg/kg BID≥3天，对照组≥3个月未用NSAID。采集颈静脉血，按标准方案制备血浆、固态PRF和液态PRF；采用多重免疫分析或ELISA定量生长因子和细胞因子；采用LC–MS/MS测定血浆氟尼辛葡甲胺浓度；采用Mann–Whitney U检验、Wilcoxon符号秩检验和Spearman秩相关进行统计分析，p < 0.05为显著。

## 3 结果

原文结果部分未设下级小标题，以下按原文段落归纳。样本采集时间为2025年4月至2026年1月。NSAID组12匹客户所有马，平均年龄13.1岁（4–23岁）；对照组12匹系统健康、近3个月无全身性NSAID使用的大学所有研究马，平均年龄9.7岁（2–16岁）；两组年龄无显著差异（t(22)=1.69，p=0.105）；对照组7匹母马和5匹阉公马，NSAID组6匹母马和6匹阉公马，性别分布无显著差异（Fisher精确检验p=1.000）。NSAID组血浆氟尼辛葡甲胺平均±标准差浓度为1623.9±1327.8 ng/mL，范围503.8至4941.2 ng/mL；对照组所有马血浆样本均未检出氟尼辛葡甲胺。IL-₆在三种血液制品中多数样本低于检测限（血浆24份中21份、固态PRF 24份中18份、液态PRF 24份中20份），因此未纳入统计分析。通过组间比较发现，固态PRF中TGF-β₁、PDGF和VEGF-A浓度在NSAID组显著低于对照组（分别为p=0.024、p=0.024和p=0.019）；固态PRF其余分析物以及血浆或液态PRF中任何分析物均未检测到组间显著差异。通过跨血液制品比较发现，血浆TGF-β₁和TGF-β₂浓度显著高于固态PRF和液态PRF（均p<0.001），固态PRF的TGF-β₁和TGF-β₂显著高于液态PRF（均p≤0.001）；固态PRF的PDGF、IL-₁β、IL-₄和TNF-α浓度显著高于血浆和液态PRF；VEGF-A在三种血液制品间无差异，血浆与液态PRF间IL-₁β、IL-₄和TNF-α浓度无差异。通过相关性分析发现，血浆氟尼辛葡甲胺浓度与液态PRF TGF-β₁（rho=?0.580）及VEGF-A（rho=?0.526）呈强负相关，提示较高氟尼辛葡甲胺浓度与这些分析物较低浓度相关；血浆氟尼辛葡甲胺浓度与液态PRF PDGF（rho=0.573）及血浆IL-₄（rho=0.577）呈强正相关，提示较高氟尼辛葡甲胺浓度与这些分析物较高浓度相关。上述液态PRF三个强相关未达显著（p=0.052、p=0.079、p=0.055），而氟尼辛葡甲胺与血浆IL-₄的强正相关显著（p=0.049）。未发现三种血液制品与甘油三酯、纤维蛋白原、血小板计数、年龄或氟尼辛葡甲胺浓度之间存在其他强相关。

## 4 讨论

讨论部分指出，本研究发现马长期全身性NSAID治疗可能影响固态PRF中生长因子浓度，NSAID组TGF-β₁、PDGF和VEGF-A显著低于对照组；研究还发现多数分析物在不同血液制品间浓度不同，且血液制品间一致性总体较差，提示血浆、固态PRF和液态PRF并非可互换的这些分析物来源。TGF-β₁、TGF-β₂、PDGF和VEGF-A是已知参与角膜创口愈合的生长因子：TGF-β₁和TGF-β₂参与上皮细胞迁移、增殖和分化调节；PDGF促进角膜成纤维细胞增殖和迁移，对角膜基质修复重要；VEGF-A是血管生成的重要介质，并在受损角膜上皮细胞中上调，提示其参与角膜愈合反应。原文认为，固态PRF中这三种生长因子增加可能解释此前报道的马、驴和犬溃疡性角膜炎愈合时间缩短的临床获益；本研究显示全身性NSAID给药与这些生长因子浓度显著降低相关，这在考虑血小板浓缩物促进愈合时可能具有临床相关性。讨论还指出，越来越多证据表明全身性NSAID可改变自体血液制品的生物分子谱，但结果仍不一致，部分研究报告生物分子浓度显著降低，另一些观察到极小或无变化，提示效应可能随药物类型、剂量和使用时长变化。Brown and colleagues评估马单次全身性抗炎药物（酮洛芬、氟尼辛葡甲胺、保泰松或非罗考昔）后的PRP样本，未发现生长因子浓度显著差异；相反，人类研究评估较长期NSAID给药（48小时至2周）后不同组织和血小板浓缩物中的细胞因子，报告全身性多种NSAID治疗后TGF-β、VEGF-A和PDGF浓度降低。本研究中马接受全身性氟尼辛葡甲胺至少3天，治疗时长长于仅评估单次NSAID剂量的马研究，这可能解释本研究与单次剂量研究之间的差异。讨论强调，NSAIDs在马医学中常用，并常纳入溃疡性角膜炎马的管理以控制眼部疼痛和反射性眼内炎症；氟尼辛葡甲胺为非选择性环氧化酶（COX；cyclooxygenase）抑制剂，常用于马眼科疼痛管理，实验证据支持其减轻角膜疼痛的疗效。角膜疾病马可能需要长期全身性NSAID治疗，尤其感染性或难愈性角膜炎；马角膜真菌病报道的治疗时长常超过1个月，链球菌性角膜炎治疗也可能同样迁延，Brooks et al.报道平均愈合时间约44.7天；非感染性角膜病也可能需要延长管理，例如惰性或难愈性溃疡马报道的平均溃疡持续时间约29天。虽然这些研究未明确报告全身性NSAID给药时长，但其表明马角膜疾病常需长疗程治疗；这与临床相关，因为接受眼表疾病治疗的马可能长期接受全身性氟尼辛，从而在使用血小板浓缩物治疗时带来重要考虑。本研究识别出多种分析物在血液制品间存在显著差异，支持血浆、固态PRF和液态PRF不应被视为可互换的生物制品。总体上，血浆和固态PRF似乎提供多种生长因子和细胞因子的最高浓度；固态PRF尤其具有较高PDGF以及IL-₁β、IL-₄和TNF-α等细胞因子浓度。人类文献描述液态PRF为能够持续释放生长因子和刺激细胞的再生生物制品；然而在本马研究中，液态PRF并未 consistently 显示高于血浆或固态PRF的分析物浓度，这一差异可能反映物种特异性差异、离心方案的轻微差异或样本采集时间差异。相关性分析在NSAID组内进行，以评估血浆氟尼辛葡甲胺浓度是否与分析物浓度变化相关。最强负相关为氟尼辛葡甲胺浓度与液态PRF TGF-β₁，其次为液态PRF VEGF-A，提示较高循环氟尼辛葡甲胺浓度可能与液态PRF中选定生长因子较低浓度相关；相反，最强正相关见于氟尼辛浓度与血浆IL-₄及液态PRF PDGF。尽管这些关系未保持统计学显著，但其幅度和方向可能具有生物学相关性。氟尼辛葡甲胺浓度与液态PRF TGF-β₁和VEGF-A的负相关尤其值得关注，因为这两种分析物在创口愈合中均发挥重要作用；这些因子减少理论上可能改变PRF的再生潜力，尤其在接受全身性NSAID的马用于创口或眼表疾病时。相反，氟尼辛浓度与血浆IL-₄及液态PRF PDGF的正相关提示NSAID治疗对血小板浓缩物组成的影响可能并非对所有分析物均一致抑制。讨论还指出，PRF为自体血液制品，其生物学组成受个体患者全身健康影响并不意外。人类医学中，糖尿病、慢性炎症性疾病和维生素D缺乏等全身性疾病已显示可改变PRF的生物学和/或机械特性；评估这些共病超出本研究范围，但类似考虑在马中可能相关。若干马病可能影响血浆和PRF产品中生长因子和细胞因子浓度；内分泌和代谢紊乱，包括马代谢综合征、胰岛素调节异常、肥胖和垂体中间部功能障碍（PPID；pituitary pars intermedia dysfunction），可能改变免疫功能。在马中，胰岛素抵抗和并发肥胖与促炎细胞因子活动包括TNF-α相关，PPID与免疫功能改变和反复感染相关；这些情况可能影响循环分析物浓度、血小板功能、白细胞活动或纤维蛋白凝块形成，最终影响PRF的生物学特征。其他慢性炎症性疾病如马哮喘也可能相关，并可能改变全身细胞因子浓度和总体免疫反应。研究局限包括样本量小，可能增加II类错误风险；NSAID治疗马入组具有挑战性，因全身性NSAID给药相关不良反应或临床顾虑常导致剂量减少或治疗中止；其他局限包括入组马代谢和内分泌状态表征不完整；尽管向主人询问已知全身性疾病且所有马均完成血液检查，但并非所有马均接受代谢或炎症性疾病特异性诊断检测。最后，研究结论翻译为：总之，该研究显示，在接受全身性氟尼辛葡甲胺治疗的马固态PRF样本中，生长因子（TGF-β₁、PDGF和VGF-A）浓度显著降低。研究结果可能提示，使用全身性NSAIDs可能削弱固态PRF的部分愈合潜力。该研究还显示，固态PRF与血浆联合处理可获得本研究所评估的全部生长因子和细胞因子的最高可能浓度。