聚羟基丁酸酯颗粒控释鸡蛋清溶菌酶抑制真空包装羊肉胀包腐败的研究

《Meat Science》：Controlled release of hen egg-white lysozyme from polyhydroxybutyrate particles for the prevention of blown pack spoilage in vacuum-packed lamb

　　

摘要：聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）生物颗粒被验证可用于鸡蛋清溶菌酶（hen egg-white lysozyme, HEWL）的控释。PHB生物颗粒的蛋白质外壳似乎介导了增强的HEWL结合。负载HEWL的PHB生物颗粒减少了羊肉中胀包腐败（blown pack spoilage, BPS）的发生。在良好生产规范（Good Manufacturing Practice, GMP）条件下生产的羊肉，采用低透气性包装并在-1.5±0.5 °C储存时，货架期为10–12周，足以出口至远方市场。在此条件下，重要的腐败原因是嗜冷梭菌属（Clostridium）物种，特别是Clostridium estertheticum，它们会引起胀包腐败。胀包腐败的特征是肉袋因气体和渗出液而膨胀，打开时散发出难闻的乳制品或硫磺气味。胴体修整过程中，当孢子从皮毛转移到肉表面时，会发生肉表面的C. estertheticum孢子污染。真空包装后，乳酸等萌发剂的积累可触发C. estertheticum孢子的萌发。尽管营养体生长可能在包装后不久随着残留氧气的消耗而开始，但该生物体在-1.5 °C下生长缓慢，通常储存约七周后才观察到可见气体产生。预防BPS具有挑战性，因为少于10个孢子/cm2就足以在冷藏真空包装羊肉中引起BPS。尽管化学和物理去污干预措施可以减少肉表面的孢子数量，但它们不提供残留抗菌活性，因此无法防止储存期间存活孢子的萌发和生长。含有抗菌功能的活性包装系统已被提议作为抑制冷藏期间C. estertheticum萌发和生长的策略。先前的研究表明，将抗菌化合物嵌入包装材料中可以延迟BPS的发生。在潜在的抗菌剂中，鸡蛋清溶菌酶已被确定为控制BPS的有希望的候选物，尽管其在红肉中对C. estertheticum的功效尚未得到直接评估。鸡蛋清溶菌酶是一种抗菌酶，在欧洲添加剂指令（E1105）下被批准作为食品防腐剂，并被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为一般公认安全（GRAS）。在酶学上，HEWL水解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4-糖苷键；然而，其抗菌活性也归因于与细菌脂质膜的非酶促相互作用。鸡蛋清溶菌酶在商业上用于奶酪制作，添加到奶酪奶中以抑制半硬质和硬质奶酪成熟期间Clostridium tyrobutyricum的生长。HEWL也已单独使用，或与膜渗透剂如乙二胺四乙酸二钠（EDTA）和乳链菌肽（nisin）联合使用，以防止鲜肉中腐败菌的生长，包括Brochothrix thermosphacta和Carnobacterium spp.。聚[(R)-3-羟基丁酸]（聚羟基丁酸酯；PHB）是一种微生物合成的聚酯，在食品包装应用中引起了越来越多的兴趣。除了用作可生物降解的生物塑料外，基于PHB的颗粒系统已被证明可作为生物活性化合物的控释载体。PHB衍生的材料也已在活性包装背景下进行了探索，能够实现抗菌剂的控释。此外，3-羟基丁酸酯/3-羟基己酸酯共聚物已被报道可结合HEWL并在体外抑制细菌生物膜形成，表明基于PHB的材料与HEWL固定化具有相容性。尽管PHB和其他食品接触生物聚合物，包括纤维素、壳聚糖和明胶，已在活性包装应用中探索用于HEWL固定化，但由于其不足的湿气和氧气阻隔性能，它们在鲜肉中的使用受到限制。因此，这些材料不适合冷藏红肉出口供应链所需的长期真空储存。另一种方法可能是将游离HEWL直接应用于肉表面，例如在包装前通过浸渍或喷涂到常规多层合成薄膜中。虽然这种策略可能赋予抗菌活性，但它需要在现有肉类加工生产线中添加额外的处理步骤和设备，这对商业应用是一个障碍。为了克服这些局限性，本研究提出将HEWL固定在PHB颗粒上，随后可将其作为涂层应用于常规塑料薄膜的内表面。研究人员评估了两种PHB颗粒系统结合和保留HEWL的能力，同时允许酶在水溶液中控释。对于此应用，强的酶保留对于在薄膜制造和涂布过程中最小化HEWL损失非常重要，这些过程可能包括洗涤步骤。然而，完全保留会限制包装后HEWL向肉表面的转移。因此，有效的递送系统必须在薄膜生产期间的酶保留与包装接触肉汁后的后续控释之间取得平衡。所评估的PHB颗粒类型是合成颗粒（由高度纯化的聚合物组成）和生物衍生的PHB颗粒（生物颗粒，从重组大肠杆菌中分离）。预期合成颗粒会结合HEWL并提供控释，而生物颗粒的蛋白质表面层可能会阻碍HEWL结合。因此，本研究的目的是比较两种颗粒类型的HEWL结合和释放能力，并调查可能影响结合的理化因素，如蛋白质含量、粒径和zeta电位。最后，进行了一项中试规模的实验室肉类试验，使用接种了C. estertheticum孢子的羊肉样品，以确定实际剂量的负载HEWL的PHB生物颗粒能否在与冷藏红肉行业相关的储存条件下预防BPS。这些发现旨在提供概念验证数据，并为未来研究将负载HEWL的生物颗粒掺入薄膜提供信息。

论文解读：聚羟基丁酸酯颗粒控释鸡蛋清溶菌酶抑制真空包装羊肉胀包腐败的研究

1. 研究背景与目的

在良好生产规范下生产的真空包装羊肉，若置于-1.5±0.5 °C的低透气性包装中储存，其货架期可达10–12周，足以满足远距离出口市场的需求。然而，在此条件下，由嗜冷梭菌属物种，尤其是Clostridium estertheticum引起的胀包腐败（BPS）成为一个重要的腐败问题。BPS的特征是包装袋因气体和渗出液积聚而膨胀，打开时伴有刺鼻的乳制品或硫磺味。肉表面的C. estertheticum孢子污染主要源自胴体修整过程中从皮毛的转移。真空包装后，乳酸等萌发剂会触发孢子萌发。尽管营养体生长可能在包装后随氧气耗尽而开始，但在-1.5 °C下其生长极为缓慢，通常需储存约七周后才出现肉眼可见的气体产生。由于少于10个孢子/cm2即可引发BPS，因此预防工作极具挑战性。现有的化学和物理去污手段虽能减少孢子数量，但因缺乏残留抗菌活性，无法阻止存活孢子在储存期间的萌发与生长。

为解决此问题，研究人员提出利用活性包装系统，通过嵌入抗菌化合物来抑制C. estertheticum。鸡蛋清溶菌酶（HEWL）作为一种广谱抗菌酶，已被批准为食品防腐剂，并在奶酪生产中用于抑制Clostridium tyrobutyricum。然而，其在红肉中针对C. estertheticum的直接效果尚未被评估。聚羟基丁酸酯（PHB）是一种微生物合成的可降解聚酯，已被探索作为生物活性化合物的控释载体。本研究旨在将HEWL固定在PHB颗粒上，开发一种可控释放系统，以平衡薄膜制造过程中的酶保留与包装后向肉表面的有效释放，从而抑制BPS。

2. 关键技术方法

研究人员采用了以下几种主要技术方法：

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  PHB颗粒制备：分别制备了三种PHB颗粒：来源于重组大肠杆菌的PHB生物颗粒（bioparticles）、由商品化PHB通过深共熔溶剂法合成的合成颗粒（synthetic particles），以及在大肠杆菌裂解液中合成的蛋白富集型合成颗粒（E. coli lysate synthetic particles）。
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  体外洗脱系列模型：将各PHB颗粒与过量HEWL孵育后，进行连续十次洗涤，测定每次洗涤后颗粒及上清液中HEWL的活性和浓度。
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  HEWL活性与定量检测：采用浊度降低法（以Micrococcus luteus为底物）测定HEWL活性，并通过SDS-PAGE结合荧光Western印迹法定量HEWL蛋白含量。
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  颗粒表征：利用动态光散射和电泳光散射测定颗粒粒径与zeta电位，通过扫描电子显微镜观察形态，并使用高效液相色谱法测定PHB含量。
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  中试肉类试验：将来自两个羊肩胛肉初切块的112份肉样随机分配至14个处理组，包括接种或不接种C. estertheticum孢子、施加不同剂量HEWL负载生物颗粒或游离HEWL的处理。样品真空包装后于2 °C储存7周，每周进行BPS视觉评估，并在实验结束时进行感官评定及实时荧光PCR检测Clostridium spp.和C. estertheticum特异性DNA。

3. 研究结果

3.1 体外洗脱系列模型中HEWL的结合与释放

在体外洗脱模型中，PHB生物颗粒表现出最高的初始HEWL活性（691 ± 53单位/g PHB），经五次洗涤后降至274 ± 63单位/g PHB，十次洗涤后仍保持138 ± 23单位/g PHB。相比之下，合成颗粒的初始活性较低（182 ± 20单位/g PHB），且在五次洗涤后几乎完全释放。Western印迹定量显示，生物颗粒的HEWL含量从1.1 g HEWL/g PHB下降至0.61 g HEWL/g PHB，而合成颗粒则从0.26 g HEWL/g PHB降至0.12 g HEWL/g PHB。生物颗粒在十次洗涤后仍持续释放HEWL至上清液，而合成颗粒的释放则在第四次洗涤后即不可检测。此外，颗粒结合HEWL的特异性活性平均比游离HEWL低2.4倍。

3.2 颗粒蛋白含量与表面特性

生物颗粒的总蛋白含量为0.80 g/g PHB，其中PhaC蛋白占主导（0.085 g/g PHB，约占总蛋白的11%），其次为大肠杆菌宿主蛋白如OmpF、OmpA和GAPDH。合成颗粒不含蛋白，而大肠杆菌裂解液合成颗粒的蛋白含量为0.28 g/g PHB。粒径测量显示，生物颗粒呈双峰分布（个体直径195 nm，聚集态908 nm），合成颗粒为单峰（417 nm），大肠杆菌裂解液合成颗粒为924 nm。zeta电位分析表明，合成颗粒（-35.9 mV）比生物颗粒（-20.5 mV）带更多负电荷。加入HEWL后，合成颗粒的zeta电位显著正向偏移至-9.1 mV，而生物颗粒的zeta电位变化不显著（-17.2 mV），表明静电相互作用在合成颗粒的结合中更为重要，但生物颗粒的蛋白外壳可能通过其他机制增强了HEWL的结合。

3.3 中试肉类试验——BPS发展

在肉类试验中，未处理对照组和空白生物颗粒对照组的羊肉样品在第七周时100%（8/8）发生BPS。相比之下，高剂量（168 μg HEWL/cm2）和低剂量（84.1 μg HEWL/cm2）的HEWL负载生物颗粒处理组中，仅有37.5%（3/8）的样品发生BPS，显著低于对照组（Fisher精确检验，P = 0.026）。游离HEWL处理组的效果与HEWL负载生物颗粒相似。感官评定结果显示，高剂量HEWL负载生物颗粒处理组的中位腐败评分为2.0，显著低于未处理对照组的3.0（Mann-Whitney U检验，P = 0.010）。

3.4 中试肉类试验——PCR检测

实时荧光PCR结果显示，几乎所有接种了C. estertheticum孢子的样品中均检出Clostridium spp. 16S rRNA，但高剂量HEWL负载生物颗粒组中有2个样品未检出。特异性PCR检测C. estertheticum subsp. estertheticum DSM8809 DNA的结果与BPS的发生显著相关（χ2检验，P < 0.001），表明BPS主要由该菌引起。

3.5 意外发现——对肉色恢复的影响

所有经生物颗粒处理的样品（无论是否负载HEWL）在开袋后均表现出较差的肉色恢复（bloom），而未经处理或仅用游离HEWL处理的样品则无此现象，差异具有统计学意义（χ2检验，P < 0.001）。这可能与生物颗粒影响表面水分滞留或与肌红蛋白相互作用有关。

4. 讨论与结论

研究表明，PHB生物颗粒作为HEWL的控释载体，其结合能力和保留特性显著优于合成PHB颗粒。生物颗粒的蛋白外壳，特别是PhaC及宿主蛋白，可能通过非静电机制（如疏水作用或二硫键交换）促进了HEWL的高效结合与缓释。在中试肉类试验中，HEWL负载生物颗粒成功抑制了C. estertheticum引起的BPS，效果与游离HEWL相当，但具有便于整合至现有包装薄膜的优势。

研究结论明确指出：PHB生物颗粒能够有效负载、保留并递送活性HEWL，其水平足以抑制真空包装羊肉中BPS的发展。这为开发涂覆有生物颗粒的常规塑料薄膜提供了概念验证，这种薄膜既能维持必要的湿气和氧气阻隔性能，又能主动缓解BPS，适用于出口市场的冷藏红肉产品。然而，生物颗粒对肉色恢复的负面影响需进一步研究解决，未来应考虑使用GRAS级别的生产菌株以简化监管审批流程。