环糊精衍生物与甾体化合物的相互作用及其在11α-OH坎瑞酮可回收提取中的应用

《Journal of Molecular Structure》：Inclusion Interactions of Cyclodextrin Derivatives with Steroidal Compounds and Their Application in the Recyclable Extraction of 11α-OH canrenone

　　•建立了一种可重复使用的HP-β-CD水相萃取平台，用于无溶剂分离发酵产生的11α-OH canrenone。•全面的表征和量子模拟阐明了HP-β-CD与11-羟基化类固醇之间的特定识别机制。•HP-β-CD在循环萃取性能上优于其他类型的CDs，其优势主要源于范德华分散力和氢键作用。

引言
类固醇作为重要的药理活性成分，广泛应用于抗炎治疗、避孕和激素替代疗法中。它们的大规模工业化生产高度依赖于生物转化（微生物发酵）技术[1]。与传统化学合成相比，微生物发酵能够在温和且环保的条件下，通过菌株的内源酶系统（如P450酶、羟化酶）实现对复杂类固醇骨架的高度区域选择性和立体选择性功能化。它有效地完成了化学合成难以实现的关键反应，包括羟基化、脱氢和侧链修饰，同时显著缩短了工艺路线并减少了废物排放，这符合绿色低碳制造的要求[2]。然而，类固醇的生物转化仍然面临显著的技术瓶颈：类固醇底物和产品具有高度的疏水性，水溶性差，倾向于吸附在微生物细胞表面，从而限制了传质效率并降低了底物利用率。此外，发酵液中含有残留底物、结构相似的副产物、蛋白质和多糖等复杂成分，导致目标产品的分离和纯化非常困难，回收率低，有机溶剂消耗量大，这限制了类固醇 pharmaceutical manufacturing 的经济性和环保性[3]。（图1）

环糊精（CDs）作为一种具有疏水性内腔和亲水性外表面的环状寡糖，可以通过主客体超分子包合作用与类固醇形成稳定的包合物，从而成为解决上述瓶颈的有效技术手段[4]。它们的核心优势包括：显著提高类固醇的水溶性，突破传质限制，增强微生物转化效率[3]；能够原位解吸吸附在细胞表面的类固醇产物，减少产物对菌株的毒性抑制，延长转化循环；依靠其内腔大小与类固醇四环骨架的特定匹配，实现目标产物的选择性识别，简化复杂发酵系统的分离和纯化过程，提高产品回收率[5]。HP-β-CD形成的包合物虽然比天然β-CD较弱，但由于其更高的内在溶解性和非晶态特性，能够携带更多的类固醇进入溶液[6]。此外，用甲基化的β-CD溶解胆固醇斑块（称为胆固醇耗竭）已被讨论用于阿尔茨海默病的治疗[7]。先前的研究表明，2-甲基-β-CD（dM-β-CD）可以从哺乳动物细胞膜中提取胆固醇并将其释放到水溶液中[8]。它们还对类固醇表现出强烈的识别作用和增强生物利用度的作用。然而，它们在实际工业分离和纯化中的应用仍然有限。因此，我们假设CDs对类固醇具有良好的包合作用能力。

不同CD与11α-OH canrenone之间的结合常数（Ks）已确定（表S1），其中HP-β-CD表现出最佳性能。大多数关于环糊精辅助类固醇萃取的研究仅涵盖了单一静态萃取，缺乏对循环性的系统研究、CDs之间的比较、工业技术经济性和环境评估以及全面的主客体表征。CDs通常在类固醇生产的生物转化阶段直接添加到发酵液中。传统的有机溶剂萃取方法存在严重的污染问题、高操作成本和低产品回收率，这些因素极大地限制了低碳和环保类固醇制造的发展[9][10][11][12]。大多数先前的出版物仅研究了单一环糊精与某一特定类固醇之间的静态包合作用[13]。少数研究系统比较了天然β-CD、甲基化β-CD、氨基改性CD、HP-β-CD和其他CD衍生物对各种类固醇底物的萃取性能。目前的计算机模拟仅进行孤立的静态分子对接计算，无法解释循环萃取条件下的动态包合-解离平衡，导致原子尺度非共价作用与实际分离过程之间的脱节[14]。此外，关于CD对11-羟基化类固醇（以11α-OH canrenone为代表）的特定识别机制的研究尚未报道，类固醇羟基取代位点对CD结合亲和力的调控规则也尚未明确[15]。现有的基于CD的萃取研究主要集中在激素类和皮质醇类固醇上，而针对含有11α-OH canrenone的原始发酵液的可回收水相萃取系统尚未开发。

本研究以11α-OH canrenone作为研究对象。该物质通过canrenone的羟基化获得[16]，在制药领域具有显著价值。这种具有药用价值的类固醇衍生物难以通过化学合成获得，并且容易吸附在发酵菌丝上。我们认为其与HP-β-CD的强烈结合归因于11α-羟基取代基。它是合成醛固酮拮抗剂的关键中间体，这些拮抗剂通过抑制人体调节水盐的醛固酮发挥利尿、保钾和降血压作用。特别是，它对于合成依普利酮（EL）至关重要[17]。依普利酮作为一种新型的选择性醛固酮受体拮抗剂，在治疗高血压和心血管疾病方面显示出良好的临床效果，显示出巨大的市场潜力[18]。由于11α-OH canrenone的水溶性极低，在微生物发酵过程中主要吸附在菌丝表面，这使得使用传统的物理分离方法（如过滤、离心或溶剂萃取）进行有效回收变得具有挑战性[19]。此外，发酵液中未转化的canrenone具有与目标产物11α-OH canrenone高度相似的物理化学性质，进一步复杂化了分离和纯化过程。因此，开发高效的萃取和纯化技术成为制备过程中的关键步骤。计算机模拟是探索环糊精-类固醇包合作用的重要工具。分子对接、分子动力学（MD）、密度泛函理论（DFT）和结合自由能计算可以可视化原子尺度的非共价作用，并预测CD的结合亲和力，从而降低实验成本[20][21][22][23][24]。大多数现有的模拟仅分析静态的单批次包合作用，忽略了发酵液中的循环萃取过程以及11α-OH canrenone的集成过程机制研究，而11α-OH canrenone是一种关键的螺内酯中间体。这种类固醇通过疏水力不可逆地附着在菌丝上，而传统的有机萃取方法不仅成本高昂且污染严重。以往的CD萃取研究仅测试了静态分离，未评估循环稳定性、CDs之间的比较以及工业经济和环境性能，主客体表征也较为有限。本研究建立了一种可回收的HP-β-CD水相萃取系统。结合多周期测试和衍生物比较，计算机模拟证实了1:1的包合化学计量比，克服了静态研究的局限性，支持大规模绿色类固醇制造。

因此，本实验旨在研究HP-β-CD与11α-OH canrenone之间的包合物形成。采用Job's图方法探讨了包合模式，并通过分子对接（MD）模拟预测了包合结构。通过粉末X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、差示扫描量热法（DSC）和扫描电子显微镜（SEM）分析了HP-β-CD/11α-OH canrenone包合物的结构特征。这些分析证实了11α-OH canrenone与HP-β-CD之间存在显著的相互作用。对不同CDs与各种类固醇的Ks值进行了比较研究（图S6）。根据比较结果及其结构（图S6），我们提出11-OH的存在增强了HP-β-CD的包合作用能力。包合物的水溶性显著提高。在实际应用中，我们验证了使用HP-β-CD作为超分子萃取溶剂进行11α-OH canrenone的循环萃取过程。为了验证循环萃取过程的可行性，我们合成了多种氨基修饰的单取代CDs（图S1-S5），其中氨基基团作为亲水“头部”。这些CDs与其他CDs作为超分子萃取溶剂进行了比较。然而，在综合考虑增强溶解性和相关制备成本的情况下，合成的氨基CDs和其他测试的CDs并未优于HP-β-CD。此外，根据测得的HP-β-CD与各种类固醇之间的Ks值（图S7-S14，表S1），我们假设HP-β-CD对类固醇的11-OH基团具有很强的识别和包合作用能力。

尽管HP-β-CD水相萃取在实验室条件下显示出出色的分离效果和可回收性，但其工业化放大面临多重挑战。大规模处理需要昂贵的浓缩设备，而高粘度的环糊精溶液与连续分离设备不兼容。用于环糊精回收的膜分离方法消耗大量能量，并且由于杂质积累而容易发生严重污染，增加了纯化成本。将这项技术整合到现有的发酵生产线中需要额外的pH调节和杂质预处理单元，从而导致额外的车间重建成本。设备兼容性、高效的环糊精回收方法、与发酵过程的兼容性以及原材料成本是限制该技术工业应用的关键瓶颈。

材料与化合物
HP-β-CD（≥99%，CAS号：128446-35-5）购自Bide Pharmatech（中国上海）。11α-OH canrenone（CAS号：192569-17-8）购自Zewei Pharmaceutical Co., Ltd.（中国云南）。N,N-二甲基乙二胺：分析级，购自上海Qiao Chemical Technology Co., Ltd。1-（2-氨基乙基）吡咯啶：分析级，购自上海Qiao Chemical。

核磁共振（NMR）和包封模式分析
NMR可以为疏水化合物成功包封到CDs中提供必要的证据。通常，当形成包合物时，CD腔内的质子（H-3, H-5）的化学位移会受到CD与疏水客体相互作用的显著影响，而腔外的质子（H-1, H-2, H-4）的化学位移基本不受影响。在堆叠光谱中可以观察到化学位移（ppm）和信号模式的变化（图1A，表1），表明...

结论
类固醇的生物转化作为一种高选择性的替代方法，可以避免繁琐的化学合成，但在工业生产中仍面临严重的产物吸附、难以从复杂发酵液中分离以及依赖大量有机溶剂的问题。传统的溶剂萃取方法带来了明显的经济和环境负担：单批次溶剂损失高达8%-12%，溶剂回收和废物处理占总成本的15%-20%。乳化和菌丝吸附限制了...

作者贡献声明
谢冰欣：研究、数据整理、初稿撰写。丁家伟：方法学、监督、审阅与编辑。李亚敏：撰写、审阅与编辑。肖飞健：概念构思、撰写、审阅与编辑。王文军：撰写、审阅与编辑。吴学伦：撰写、审阅与编辑。蔡俊宇：监督、撰写、审阅与编辑。杨波：撰写、审阅与编辑、监督、资金获取、项目管理。

利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

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